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Item Structure and function of enzymes and auxiliary proteins from Trichoderma, active in cell-wall hydrolysis(2017-05-29) Polikarpov, IgorLignocellulosic biomass, such as sugarcane bagasse, holds a promise of environmentally friendly bioenergy production in Brazil. However, enzymatic hydrolysis, currently considered a method of choice in biomass saccharification, is hampered by considerable cell-wall recalcitrance. To make this technology sustainable and cost effective, our comprehension of cellulose enzymatic hydrolysis should be significantly improved. Here we propose to conduct systematic structure-functional studies of Trichoderma cellulases and auxiliary proteins active in cell-wall degradation using a combination of X-ray protein crystallography, biophysical and biochemical studies, molecular dynamics simulations, statistical coupling analysis aligned with the site-directed mutagenesis and enzymatic assays aiming to obtain in-depth comprehension of cellulose hydrolysis. We plan to contribute toward structural analysis of Trichoderma reesei endoglucanases by solving a crystal structure of endoglucanase II (Cel5A), main enzymatically active, but structurally uncharacterized endoglucanase of this important industrial fungus. Moreover, we will contribute toward our knowledge of Trichoderma cellulases molecular organization by solving X-ray structures of main Trichoderma harzianum endo- and exoglucanases (primarily focusing on Cel7A and Cel5A) and by comparing them with the correspondent T. reesei enzymes. We also aim to structurally characterize swollenins, non-hydrolytic proteins, shown to enhance cellulose hydrolysis catalyzed by celulases, and to study thermodynamically its interactions with cellulose. In addition, we will construct chimeric enzymes by fusing of swollenin with the cellulases and will study enzymatic properties of such chimeras. Furthermore, we will conduct systematic molecular dynamics studies of the cellulases and swollenin, and investigate their flexibility by hydrogen deuterium exchange followed by massspectrometry. Finally, we will use all these acquired knowledge to modify the proteins using site-directed mutagenesis aiming to better comprehend molecular basis of their function and to produce enzymes and their mixtures with enhanced hydrolytic properties.Item Produção heteróloga, caracterização e engenharia de Xilose isomerases para aplicação na fermentação industrial de pentoses.(2017-05-29) Polikarpov, IgorPara tornar a produção de etanol de segunda geração economicamente sustentável, é imprescindível utilizar fração hemicelulósica. As pentoses (P5), que compõem a hemicelulose, não são fermentescíveis pelas leveduras (Saccharomyces cerevisiae) utilizadas pela indústria brasileira. A xilose, uma fração predominante de P5, pode ser robustamente convertida pela ação de xilose isomerases (Xls) em xilulose, que, por sua vez, é facilmente fermentada pela S. cerevisiae. Neste projeto estamos propondo utilizar ferramentas modernas de bioinformática, genética, expressão heteróloga de alta produtividade e Biologia/Bioquímica Molecular Estrutural para identificar, clonar e expressar em larga escala Xls novas e potencialmente patenteáveis. Estamos objetivando também o estudo enzimático e de modificação das mesmas usando engenharia de proteínas, visando produzir enzimas com alta atividade enzimática e perfis de pH e temperatura compatíveis às condições do processo industrial brasileiro. Além disso, imobilizaremos as Xls otimizadas para aumentar sua vida útil e viabilizar seu reciclo. Faremos pré-tratamento do bagaço da cana para obter um hidrolisado hemicelulósico, e conduziremos testes de isomerização e fermentação simultâneos de P5 usando leveduras comerciais e industriais em condições reacionais próximas às encontradas nas usinas do País. É importante ressaltar que este processo não utiliza organismos geneticamente modificados e é, portanto mais facilmente escalonável para os processos industriais brasileiros.Item Estudos estruturais de proteínas usando luz síncrotron(2017-05-29) Polikarpov, IgorAté o presente momento a cristalografia macromolecular é o método mais poderoso e também o mais utilizado para a solução de estrutura tridimensional de proteínas e ácidos nucleicos com resolução atômica ou quase atômica. Estas estruturas tridimensionais estão contribuindo na compreensão de vários processos presentes nas células vivas, tais como catalização enzimática, resposta imunológica, infeção viral, divisão celular, transferência de informação genética, entre outros. Além disso, o conhecimento das estruturas das proteínas é essencial para o desenho de novas drogas e modificações de proteínas através da engenharia genética. O Brasil é único país do Hemisfério sul que possui síncrotron com linha de luz dedicada a cristalografia de proteínas. A linha de luz que começou a funcionar cerca de um ano e meio atrás, apresenta o fluxo de raios-X bastante elevado e já serviu para realização de mais de 60 diferentes projetos cristalográficos do Brasil e de outros países como Argentina, México, Rússia, Alemanha, Austrália e Estados Unidos. O interesse principal deste projeto é o desenvolvimento de métodos e equipamentos específicos ao estudo de cristalografia de proteínas com luz síncrotron, bem como a otimização destes métodos para condições de coleta de dados na linha de cristalografia de proteínas do LNLS. Isto tornaria mais fácil e mais rápido a determinação da estrutura tridimensional (3D)de moléculas de proteínas para a compreensão das suas funções. Otimização de coleta de dados nativos e derivados, incluindo técnicas de substituição isomorfa múltipla/simples com espalhamento anômalo (MIRASISIRAS) e difração anômala à único/múltiplos comprimento(s) de onda (SADIMAD), será aplicada no caso de quinze projetos estruturais diferentes. Estes sub-projetos serão resolvidos usando o métodos de substituição molecular (II.1, II.2, II.5- II.8, II.12- II.15 e, possivelmente,11.4), técnicas de substituição isomorfa e difração anômala (II.3, II.4, II.9- II.11). Estudos estruturais com resolução atômica serão realizados dentro do sub-projeto II. 14, e possivelmente outros sub-projetos. Técnicas crio-cristalográficas estão sendo otimizadas para uso na linha de cristalografia de proteínas do LNLS e serão plenamente usadas durante de execução do projeto. Sub-projetos estruturais estão direcionados para estudos de proteínas relacionadas com problemas de saúde humana (II. 1, II.3, II.4, II.6), infecção viral (II.5), tratamento de câncer (II.2), processos inflamatórios (II.7), envenenamento(II.14, II.15); aplicações industriais (II.9- II.11); estudos biológicos de proteínas glicosiladas (H. 1, 11. 8-H.11) e proteínas da via glicolítica (11. 12, H. 13).As proteínas em estudo variam de pequeno peptídeo não-glicosilado (7.5kDa) a moléculas grandes e pesadamente glicosiladas (~100 kDa, 15% de glicolisação). As técnicas de luz síncrotron são o pivô e o elo de ligação dos projetos. Muitos deles seriam difíceis ou, as vezes impossíveis, de serem realizados sem uso de luz síncrotron. Desenvolvimento de técnicas modernas de uso de luz síncrotron aplicadas à biologia molecular estrutural e testes rigorosos das mesmas durante execução de grande número de projetos estruturais aumentará significativamente a velocidade e qualidade de coleta de dados e resolução das estruturas. Isto criará a base para futuros projetos de genoma estrutural e desenho racional de fármacos. Os avanços técnicos e tecnológicos alcançados durante a execução deste projeto beneficiarão toda a comunidade cristalográfica do Brasil e Mercosul. A riqueza de informação estrutural coletada neste projeto poderá sugerir novas soluções para problemas relacionados a saúde humana, medicina e aplicações industriais. O projeto temático esta dividido em duas partes: estudos metodológicos e estudos estruturais. Na parte dos estudos metodológicos prevemos otimizar os métodos de coleta de dados de difração dos cristais nativos e derivados com luz síncrotron, visando particularmente resolução das estruturas inéditas. Na parte dos estudos estruturais apresentamos 15 propostas de pesquisa de determinação das várias estruturas protéicas de interesse biológico.Item Biofísica estrutural dos receptores nucleares e proteínas relacionadas(2017-05-29) Polikarpov, IgorOs receptores nucleares estão dentre as mais importantes moléculas envolvidas na regulação intracelular, pois participam na transmissão de diferentes sinais internos e externos para a regulação de programas genéticos. A programação genética estabelecida ou modificada por essas proteínas afeta praticamente todos os aspectos da vida de organismos multicelulares. A regulação transcricional e a seletividade promovida pelos receptores nucleares estimulam a intensa pesquisa que vêm sendo realizada na tentativa de decifrar a complexa rede de eventos moleculares que promovem a sua capacidade de regulação da transcrição e descobrir as regras que definem seu controle, no espaço e no tempo, sobre as interações proteína-proteína e proteína-DNA, abrindo possibilidades para o desenvolvimento de drogas mais eficientes com valores terapêuticos superiores. No presente projeto, planeja-se estudar os receptores nucleares por cristalografia de proteínas, espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), métodos bioquímicos e biofísicos, bem como por simulações biocomputacionais, para se entender como a ligação de ligantes específicos (agonistas e antagonistas) induz respostas conformacionais na estrutura tridimensional dos receptores e influencia seus estados de oligomerização e as interações com proteínas co-reguladoreas (co-ativadoras e co-repressoras), bem como modifica a sua estabilidade. Planeja-se também estudar o reconhecimento dos elementos responsivos de DNA por receptores nucleares por cristalografia de proteínas, SAXS e anisotropia de fluorescência. Finalmente, planeja-se investigar papel de dinâmica dos receptores nucleares no seu funcionamento, objetivando determinação dos caminhos preferenciais de dissociação dos ligantes dos receptores nucleares através de simulações computacionais pro dinâmica molecular e os estudos experimentais das mudanças da mobilidade dos receptores usando a técnica de troca hidrogênio/deutério em combinação de espectroscopia de massa. É importante ressaltar que estas são metas com impacto imediato na procura racional de agonistas ou antagonistas hormonais e se inserem dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de receptores nucleares com vínculos estreitos com os interesses da indústria farmacêutica, da medicina e do setor produtivo.Item EMU: facility para estudos avançados de materiais nanoestruturados e biossistemas / FAMA(2017-05-29) Polikarpov, IgorEsta proposta visa modernizar e ampliar um Laboratório Multiusuário Centralizado (Facility), que funciona há mais de 20 anos no IFSC/ USP fazendo pesquisas e prestando serviços em materiais inorgânicos e orgânicos por meio das técnicas de microscopia eletrônica de varredura (SEM), microscopia de força atômica (AFM) e difração de raios-X (DRX), atendendo pesquisadores do Estado de São Paulo e de outros estados da federação. A modernização e a ampliação agregarão técnicas modernas de microscopia confocal e difração de raios-X com duplo comprimento de onda, como também de microscopia de alta resolução, adquirindo um microscópio eletrônico SEMFEG e um microscópio de força atômica (AFM) de última geração. Com esta expansão do laboratório será possível estender a gama de materiais investigados e atender a um maior número de pesquisadores, com pessoal altamente qualificado. Além disso, a ênfase multidisciplinar crescente do IFSC trouxe demandas novas por metodologias que possibilitem investigar nanoestruturas orgânicas e inorgânicas, matéria mole, biomassa e biossistemas em geral (microscopia confocal). O projeto é apoiado por dois Cepids da FAPESP, três INCTs, três Temáticos, um projeto regular da FAPESP e um projeto da Finep, como projetos associados, que totalizam mais de R$ 75 milhões em recursos financeiros, além de vários projetos complementares. Nesses projetos busca-se compreender processos físicos, físico-químicos e biológicos na escala atômica e nanométrica, em áreas de fronteira em que os grupos participantes desta proposta têm contribuições relevantes no cenário internacional. Devido à abrangência estadual e nacional de alguns dos projetos associados, um número considerável de pesquisadores e especialistas em inovação tecnológica do Estado de São Paulo será beneficiado, principalmente com a infraestrutura e capacitação de técnicos do IFSC para compartilhar equipamentos multiusuários.Item Estabelecimento de uma colaboração para estudos sistemáticos de proteínas transportadoras presentes em membranas através da cristalografia de macromoléculas(2017-05-11) Polikarpov, IgorAs bactérias gram-negativas possuem uma membrana celular dupla que lhes proporcionam uma camada extra de proteção, todavia, dificulta a passagem, por exemplo, de alvos terapêuticos e de substratos para subsequente fermentação. Dessa maneira, a compreensão do envelope celular em detalhes moleculares é essencial para o aprimoramento de nossas habilidades em explorar suas fragilidades para aplicações médicas e ampliaria a eficiência na obtenção do biocombustível. Contudo, devido à dificuldade no estudo das proteínas de membrana, até a presente data, a cristalografia de raios-X de proteínas de membrana ainda é inacessível no Brasil. Este projeto alvitra a consolidação de uma união entre dois grupos de pesquisa em universidades de excelência, a Universidade Birmingham (UoB) e a Universidade de São Paulo (USP), e aponta, pela primeira vez, estabelecer um estudo estrutural colaborativo especializado em proteínas de membrana e que será de grande benefício para ambas as instituições.Item Uso de foto-estimulação para aceleração da fermentação no processo de produção de cerveja e chope(República Federativa do Brasil - Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior - Instituto Nacional da Propriedade Industrial, 2013-04-16) Estracanholli, Everton Sergio; Polikarpov, Igor; Bagnato, Vanderlei SalvadorRefere-se a presente patente de invenção na utilização de fontes de luz - Laser ou LEDs ou Lâmpadas Fluorescentes, como forma de acelerar o processo de fermentação do mosto cervejeiro, que posteriormente irá se transformar em cerveja ou chope, ficando apto para o consumo, diminuindo assim o tempo de produção, diminuindo também o custo de produção e aumentando a capacidade produtiva.Item Target analysis of microbial lignocellulytic secretomes: a new approach to enzyme discovery(2016-11-04) Polikarpov, IgorFrom both a fundamental and industrial biotech viewpoint understanding the deconstruction of lignocellulose in soil and compost is of central importance. In the natural environments microbial communities can efficiently degrade or modify lignin to enable the effective enzymatic hydrolysis of the polysaccharides present in plant cell walls. The aim of this proposal is to use metatranscriptomics and proteomics to determine gene - and protein - centred details to determine new mechanisms and improved methods of lignocellulose deconstruction in mixed microbial communities from composting wheat straw and sugar cane bagasse. Secreted proteins will be tagged, affinity purified and analyzed by LC-ESI-MS. In order to have a picture of the overall community dynamics in terms of species composition during the composting process DNA will be extracted for SSU rRNA profiling: Saccharification of the lignocellulose will be monitored and the lignin content of the straw or bagasse analyzed using FTIR spectroscopy and solid state NMR. Metatranscriptome analysis will be performed by preparing cDNA from samples taken at various time points from the Iignocellulose enriched cultures, the cDNA will be sequenced using the Roche 454 GS FLX Titanium platform. The peptide sequences from the proteomics analysis will allow the identification of full and partial coding sequences in the library. These coding sequences will be cloned and expressed in established recombinant expression systems and the recombinant proteins screened for activity.Item Sistema de injeção de gases para retores [i.e. reatores] de agitação pneumática(República Federativa do Brasil - Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior - Instituto Nacional da Propriedade Industrial, 2016-05-03) Polikarpov, Igor; Sejeghim Júnior, Paulo; Monteiro, Patrícia Aparecida SantiagoA presente invenção trata um sistema de injeção de gases (1) para reatores de agitação pneumática que é consistido de uma base (2) que compreende uma câmara acumuladora de gases (3) e os injetores (4); que pode ser usado tanto em reatores do tipo airlift, como em reatores do tipo coluna de bolhas, proporcionando a necessidade de uma menor quantidade de ar para agitar e misturar o meio reacional, e um menor custo energético de funcionamento do reator.Item Sistema de monitoramento da produção e fermentação do mosto cervejeiro por espectroscopia de absorção no infravermelho(República Federativa do Brasil - Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior - Instituto Nacional da Propriedade Industrial, 2014-03-18) Kurachi, Cristina; Estracanholli, Everton Sergio; Polikarpov, Igor; Bagnato, Vanderlei SalvadorA presente patente de invenção refere-se a um sistema de monitoramento da produção e fermentação do mosto cervejeiro utilizando a absorção óptica na região espectral do infravermelho, que abrange o intervalo de número de onda entre 975 cm-1 e 1190 cm-1, tomando o processo mais eficiente e obtendo um produto final mais apurado e com melhor qualidade e com economia de tempo e dinheiro.