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Item Cristalografia, modelagem molecular e planejamento de substâncias de interesse biológico(2017-05-31) Mascarenhas, Yvonne PrimeranoO objetivo deste projeto é a realização de trabalhos visando à determinação da estrutura molecular de proteínas. Utilizando-se técnicas computacionais e bancos de dados de estrutura primária e de estruturas moleculares de proteínas determinadas pelos métodos de difração serão feitas previsões de estrutura molecular de proteínas com estrutura primária conhecida. Poderão também ser analisadas variações conformacionais decorrentes de associação de proteínas com substratos. Sempre que houver disponibilidade de quantidade adequada de amostras serão realizados ensaios de cristalização visando à obtenção de monocristais adequados para uso por métodos de difração de raios-x.Item Estudos estruturais de endopeptidases glutamato-especificas, proteínas envolvidas no metabolismo de amino-acucares e a proteína de reserva 25: modelagem molecular e cristalografia(2017-05-29) Garratt, Richard CharlesEste projeto tem como finalidades a modelagem molecular de vários endopeptidases glutamato-específicas (EGE's) e a purificação de uma delas (a EGE de Bacillus licheniformis, GSE-BL) visando à determinação da sua estrutura tridimensional. Estas enzimas são parentes distantes da família tripsina de serino-proteases, e através das estruturas tridimensionais desenvolvidas no projeto pretende-se entender melhor a base estrutural da sua especificidade incomum, bem como o mecanismo molecular da síndrome da pele queimada ("Staphyloccoal Scalded Skin Syndrome") causada pelas toxinas epidermolíticas que são moléculas homólogas. A enzima purificada também tem aplicações na área de seqüenciamento de proteínas, pois a enzima equivalente que é tradicionalmente utilizada para fragmentação de proteínas (a protease V8 de S. aureus) é extremamente cara. A alta atividade da EGE de B. licheniformis em comparação com a protease V8 sugere que ela poderá substituí-la para esta finalidade.Item Estudos estruturais de proteínas usando luz síncrotron(2017-05-29) Polikarpov, IgorAté o presente momento a cristalografia macromolecular é o método mais poderoso e também o mais utilizado para a solução de estrutura tridimensional de proteínas e ácidos nucleicos com resolução atômica ou quase atômica. Estas estruturas tridimensionais estão contribuindo na compreensão de vários processos presentes nas células vivas, tais como catalização enzimática, resposta imunológica, infeção viral, divisão celular, transferência de informação genética, entre outros. Além disso, o conhecimento das estruturas das proteínas é essencial para o desenho de novas drogas e modificações de proteínas através da engenharia genética. O Brasil é único país do Hemisfério sul que possui síncrotron com linha de luz dedicada a cristalografia de proteínas. A linha de luz que começou a funcionar cerca de um ano e meio atrás, apresenta o fluxo de raios-X bastante elevado e já serviu para realização de mais de 60 diferentes projetos cristalográficos do Brasil e de outros países como Argentina, México, Rússia, Alemanha, Austrália e Estados Unidos. O interesse principal deste projeto é o desenvolvimento de métodos e equipamentos específicos ao estudo de cristalografia de proteínas com luz síncrotron, bem como a otimização destes métodos para condições de coleta de dados na linha de cristalografia de proteínas do LNLS. Isto tornaria mais fácil e mais rápido a determinação da estrutura tridimensional (3D)de moléculas de proteínas para a compreensão das suas funções. Otimização de coleta de dados nativos e derivados, incluindo técnicas de substituição isomorfa múltipla/simples com espalhamento anômalo (MIRASISIRAS) e difração anômala à único/múltiplos comprimento(s) de onda (SADIMAD), será aplicada no caso de quinze projetos estruturais diferentes. Estes sub-projetos serão resolvidos usando o métodos de substituição molecular (II.1, II.2, II.5- II.8, II.12- II.15 e, possivelmente,11.4), técnicas de substituição isomorfa e difração anômala (II.3, II.4, II.9- II.11). Estudos estruturais com resolução atômica serão realizados dentro do sub-projeto II. 14, e possivelmente outros sub-projetos. Técnicas crio-cristalográficas estão sendo otimizadas para uso na linha de cristalografia de proteínas do LNLS e serão plenamente usadas durante de execução do projeto. Sub-projetos estruturais estão direcionados para estudos de proteínas relacionadas com problemas de saúde humana (II. 1, II.3, II.4, II.6), infecção viral (II.5), tratamento de câncer (II.2), processos inflamatórios (II.7), envenenamento(II.14, II.15); aplicações industriais (II.9- II.11); estudos biológicos de proteínas glicosiladas (H. 1, 11. 8-H.11) e proteínas da via glicolítica (11. 12, H. 13).As proteínas em estudo variam de pequeno peptídeo não-glicosilado (7.5kDa) a moléculas grandes e pesadamente glicosiladas (~100 kDa, 15% de glicolisação). As técnicas de luz síncrotron são o pivô e o elo de ligação dos projetos. Muitos deles seriam difíceis ou, as vezes impossíveis, de serem realizados sem uso de luz síncrotron. Desenvolvimento de técnicas modernas de uso de luz síncrotron aplicadas à biologia molecular estrutural e testes rigorosos das mesmas durante execução de grande número de projetos estruturais aumentará significativamente a velocidade e qualidade de coleta de dados e resolução das estruturas. Isto criará a base para futuros projetos de genoma estrutural e desenho racional de fármacos. Os avanços técnicos e tecnológicos alcançados durante a execução deste projeto beneficiarão toda a comunidade cristalográfica do Brasil e Mercosul. A riqueza de informação estrutural coletada neste projeto poderá sugerir novas soluções para problemas relacionados a saúde humana, medicina e aplicações industriais. O projeto temático esta dividido em duas partes: estudos metodológicos e estudos estruturais. Na parte dos estudos metodológicos prevemos otimizar os métodos de coleta de dados de difração dos cristais nativos e derivados com luz síncrotron, visando particularmente resolução das estruturas inéditas. Na parte dos estudos estruturais apresentamos 15 propostas de pesquisa de determinação das várias estruturas protéicas de interesse biológico.Item Biofísica estrutural dos receptores nucleares e proteínas relacionadas(2017-05-29) Polikarpov, IgorOs receptores nucleares estão dentre as mais importantes moléculas envolvidas na regulação intracelular, pois participam na transmissão de diferentes sinais internos e externos para a regulação de programas genéticos. A programação genética estabelecida ou modificada por essas proteínas afeta praticamente todos os aspectos da vida de organismos multicelulares. A regulação transcricional e a seletividade promovida pelos receptores nucleares estimulam a intensa pesquisa que vêm sendo realizada na tentativa de decifrar a complexa rede de eventos moleculares que promovem a sua capacidade de regulação da transcrição e descobrir as regras que definem seu controle, no espaço e no tempo, sobre as interações proteína-proteína e proteína-DNA, abrindo possibilidades para o desenvolvimento de drogas mais eficientes com valores terapêuticos superiores. No presente projeto, planeja-se estudar os receptores nucleares por cristalografia de proteínas, espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), métodos bioquímicos e biofísicos, bem como por simulações biocomputacionais, para se entender como a ligação de ligantes específicos (agonistas e antagonistas) induz respostas conformacionais na estrutura tridimensional dos receptores e influencia seus estados de oligomerização e as interações com proteínas co-reguladoreas (co-ativadoras e co-repressoras), bem como modifica a sua estabilidade. Planeja-se também estudar o reconhecimento dos elementos responsivos de DNA por receptores nucleares por cristalografia de proteínas, SAXS e anisotropia de fluorescência. Finalmente, planeja-se investigar papel de dinâmica dos receptores nucleares no seu funcionamento, objetivando determinação dos caminhos preferenciais de dissociação dos ligantes dos receptores nucleares através de simulações computacionais pro dinâmica molecular e os estudos experimentais das mudanças da mobilidade dos receptores usando a técnica de troca hidrogênio/deutério em combinação de espectroscopia de massa. É importante ressaltar que estas são metas com impacto imediato na procura racional de agonistas ou antagonistas hormonais e se inserem dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de receptores nucleares com vínculos estreitos com os interesses da indústria farmacêutica, da medicina e do setor produtivo.Item Caracterização molecular e estrutural do Leishmania RNA vírus LRV1-4(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueAlém do inegável impacto em saúde humana e de animais domésticos, o estudo dos protozoários (Reino Protista) é de grande relevância pela diversidade de espécies, muitas ainda desconhecidas, e sua importância evolutiva no surgimento de eucariotos. Desta forma, o estudo de diversos aspectos da biologia de protozoários, parasitas ou não, se justifica. O Leishmania RNA vírus 1-4 (LRV1-4) é um vírus classificado como pertencente a família Totiviridae. Possui capsídeo icosaédrico de genoma composto por RNA de dupla fita (dsRNA) que codifica duas proteínas, uma capsidial e uma RNA polimerase. Sendo pouco estudado, mas com indicação de ter relevancia na invasão celular de Leishmania, iniciamos a caracterização molecular deste vírus com o objetivo de empreender estudos estruturais e funcionais. Dados recentes indicam o envolvimento do LRV1-4 na patogênese de Leishmania no hospedeiro humano, tornando seu estudo de fundamental importância para o entendimento dessa doença e de seu papel na relação parasito-hospedeiro. Trabalhos recentes desenvolvidos por nosso laboratório resultaram no estabelecimento de uma metodologia de purificação de partículas de LRV1-4 com o qual obtivemos imagens inéditas de Microscopia Eletrônica de Varredura do capsideo. Na presente proposta, com base nos procedimentos já estabelecidos, daremos continuidade aos estudos de Microscopia Eletrônica de Varredura por Negative Staining e Crio-Microscopia Eletrônica, caracterização molecular e estrutural do capsideo viral extraído de células infectadas de Leishmania guyanensis e de caspideos recombinantes expressos em Leishmania tarentolae. Os estudos aqui propostos deverão permitir a construção de um modelo estrutural do capsídeo do LRV1-4 e contribuir no entendimento do processo de replicação, a confirmação (ou não) dentre os Totiviridae e o seu papel na relação parasito-hospedeiro. Além das contribuições ao conhecimento da biologia/patogenia do LRV1-4 este estudo representa a primeira caracterização estrutural de um capsideo viral realizada no Brasil e assim um avanço importante para a área de virologia e biologia estrutural no pais.Item Biossíntese de selenocisteína: estudos estruturais e validação por RNAi(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueA via de síntese do 21° aminoácido (selenocisteina - Sec - U) representa a principal forma biológica de selênio. A sua síntese e incorporação em selenoproteínas depende de um códon de terminação UGA em fase e uma estrutura terciária do mRNA (SECIS). Recentemente identificamos a existência da via de síntese de selenocisteínas e os respectivos genes para SELE, SELD, PSTK, SECp43 e os tRNASerSec (SeIC) em todos os Kinetoplastida. Um gene candidato a selenoproteína, Sell foi identificado em L. major e L. infantum. Em Kinetoplastida esta via representa um alvo em potencial no estudo do mecanismo de interação e especificidade entre proteínas e tRNAs bem como uma possível via para desenho de inibidores. A cristalização e determinação da estrutura 3D dos componentes desta via de Kinetoplastida (Leishmania major e Trypanosoma brucei) bem como a validação desta via como potencial alvo para o desenho de inibidores por técnica de RNA de interferência são os objetivos principais deste projeto.Item Aplicação dos princípios de evolução in vitro em estudos de função e estrutura da hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase de Leishmania tarentolae(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueAs leishmanioses estão dentre as mais devastadoras doenças humanas. Entretanto não se possui uma medida de tratamento eficiente e segura dos indivíduos infectados. Estes organismos se destacam por serem auxotróficos para purinonucleotídeos. Com a finalidade de desenvolver novas formas de quimioterapia, a via de recuperação se apresenta como uma ideia candidata a esse fim. Objetivando complementar a pesquisa em andamento pretendemos empregar técnicas de evolução in vitro (DNA shuffling) para a seleção de mutantes do gene HGPRT de Leishmania. Esses serão sequenciados e estudos cinéticos serão realizados. As enzimas mutadas poderão ser posteriormente cristalizadas e sua estrutura resolvida. Esta informação levará a um melhor entendimento do mecanismo de catálise e ao desenho de inibidores.Item Cristalografia estrutural como ferramenta na avaliação de ligações dpi-s;de mecanismos de reação de complexos contendo a unidade {Ru-NO} Diante de tióis e na identificação de compliexos tetrâmeros de Ru(II)(2017-05-16) Castellano, Eduardo ErnestoO presente projeto visa à aplicação das técnicas de determinação de estruturas por difração de raios-X em monocristais ao estudo das ligações e reações em complexos de Ru (II) e Ru (III) e à comparação dos resultados com aqueles provenientes de outras técnicas, tais como NMR, UV, IV, etc. Os objetivos específicos são a avaliação de ligações dPi-Sem complexos de Ru (III) contendo diferentes tipos de ligantes orgânicos, a analise dos mecanismos de reação de complexos do tipo [RuCl3(P-P) (NO)] (P-P = bifosfina) com tiois e o estudo da formação de tetrâmeros com formulação [RuCl2(PPh3)2(L-L)].Item Septinas: estudos comparativos visando correlacionar estrutura e função(2017-05-12) Garratt, Richard CharlesA presente proposta foca aspectos estruturais e funcionais da família das septinas utilizando uma abordagem integrada composta por uma série de técnicas biofísicas e celulares. Embora descritos pela primeira vez em levedura a cerca de 40 anos atrás, onde são essenciais para completar o ciclo celular, septinas ainda são consideradas um componente do citoesqueleto neglegenciado em termos da sua bioquímica e fisiologia. Por exemplo, sabe-se pouco ainda sobre os fatores que controlam a formação de um heterofilamento de septinas e como isto está relacionado com a ligação e hidrólise de GTP e a associação com membranas celulares. Além disto, das dezenas de hetero-filamentos de septinas teoricamente possíveis, apenas uma única estrutura cristalográfica foi reportada até os dias de hoje e, mesmo assim, a baixa resolução. Sabe-se menos ainda sobre o papel de septinas em organismos inferiores. A presente proposta de pesquisa está dividida em três sub-projetos que abordam respectivamente aspectos da estrutura, função e relação evolucionária de septinas de diferentes organismos, incluindo o homem, um helminto, um cefalocordado e uma alga. Em termos estruturais procuraremos visualizar diretamente filamentos e protofilamentos usando microscopia eletrônica e resolver estruturas cristalográficas por difração de raios-X e RMN de septinas individuais e seus heterocomplexos, além dos seus domínios isolados na presença de ligantes, tais como GTP, GDP e Mg2+. Os resultados serão complementados por estudos funcionais visando identificar por exemplo, parceiros das septinas em algas verdes e os mecanismos de parálise de Schistosoma mansoni induzido pela inibição de septinas in vivo.Item Caracterização no estado sólido de fármacos anti-HIV: planejamento racional de novas formas cristalinas(2017-05-11) Ellena, Javier AlcidesO presente projeto de pesquisa é dedicado à síntese de novas formas cristalinas de fármacos consolidados na terapêutica anti-HIV, seguido de caracterização das propriedades físicas e químicas no estado sólido. Fármacos anti-HIV pertencentes às classes dos inibidores de transcriptase reversa nucleosídicos e não nucleosídicos e inibidores de HIV aspartato protease serão sujeitos de ensaios de cristalização para obtenção de modificações cristalinas com propriedades farmacocinéticas aprimoradas em relação às fases sólidas utilizadas nas formulações de medicamentos administrados em formas farmacêuticas sólidas. Este melhoramento das características farmacocinéticas se deve, principalmente, à alteração das propriedades de solubilidade e dissolução de acordo com a fase cristalina que se encontra um determinado fármaco. Uma atenção especial será dada aos inibidores de transcriptase reversa nucleosídicos, devido à relevância destes fármacos dentro dos esquemas terapêuticos anti-AIDS. Para a obtenção destas novas fases cristalinas, serão empregadas tanto estratégias de síntese racional, onde a escolha de solventes e agentes de co-cristalização é fundamentada com base em aspectos moleculares e supramoleculares dos fármacos e dos adjuvantes de cristalização, quanto métodos randômicos, os quais se baseiam na procura de formas cristalinas através da investigação sistemática sob diferentes condições de cristalização. Os materiais cristalinos obtidos serão caracterizados por técnicas de microscopia fotônica e eletrônica de varredura, difração de raios X por monocristal e pó, espectroscopia vibracional no infravermelho por transformada de Fourier e de Raman, análise termogravimétrica e calorimetria diferencial de varredura, bem como a solubilidade e dissolução serão estimadas.