Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Dinâmica molecular e redes complexas no estudo da difusão térmica em xilanases da família 11(2013-09-26) Censoni, Luciano BorgesProteínas tipicamente são capazes de manter a sua conformação funcional somente dentro de um intervalo limitado de temperaturas. A despeito do maquinário sofisticado de manutenção da homeostase celular, é sabido que uma variedade de fenômenos moleculares são capazes de induzir desequilíbrios localizados de energia vibracional, e que a eficiência com que cada proteína dissipa estas perturbações pode estar relacionada com a sua tolerância a altas temperaturas. No entanto, a transferência de energia térmica entre diferentes segmentos de uma cadeia proteica é difícil de caracterizar experimentalmente. Uma alternativa teórica para a investigação destes mecanismos é o emprego de simulações de Dinâmica Molecular, particularmente associadas à técnica de Difusão Térmica Anisotrópica (ATD). Aqui, verificamos a possibilidade de empregar conceitos da teoria de Redes Complexas para construir modelos para estruturas de proteínas, e por meio destes identificar resíduos com capacidade significativa de dissipar perturbações térmicas. Investigamos os diversos protocolos de construção de modelos de rede para proteínas encontrados na literatura, e utilizamos dados experimentais representativos da base SCOP para calcular com rigor os parâmetros numéricos necessários. Produzimos uma definição precisa para o conceito de contato entre resíduos de aminoácidos, e a partir desta calculamos a centralidade de cada resíduo. Com isto, demonstramos que, em um conjunto de Xilanases para as quais dispomos de dados de ATD, a capacidade de difundir perturbações térmicas é fortemente correlacionada com a centralidade de proximidade de cada resíduo, fornecendo argumentos para o uso de modelos de rede para estudar a termoestabilidade de proteínas.Item Compreensão da estrutura de proteínas por estudantes de nível superior, na perspectiva da teoria dos modelos mentais de Johnson-Laird(2013-04-09) Silva, Marília Faustino daA Biologia Molecular e a Biotecnologia e seus conceitos subjacentes estão inseridos no currículo escolar da educação básica e têm estado presentes na vida cotidiana dos estudantes, envolvendo a análise e tomada de decisão sobre aspectos éticos relacionados à produção e aplicação do conhecimento científico e tecnológico. As explicações de alguns fenômenos e processos relacionados a estes temas estão quase sempre no nível molecular e atômico, que é descrito e explicado com modelos conceituais e físicos, ou até mesmo imagens. À luz da Teoria dos Modelos Mentais de Johnson-Laird, as pessoas raciocinam através de modelos mentais, podendo utilizar outras formas de representações mentais como proposições e imagens. Nesse contexto propôs-se diagnosticar entre treze alunos dos cursos de Licenciatura em Ciências Exatas (LCE) e Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares (CFBio), ambos cursos da Universidade de São Paulo, quais as representações mentais que esses alunos possuíam sobre o tema proteínas, bem como a contribuição de uma sequência didática utilizando modelos táteis para o ensino e aprendizagem da estrutura e função de proteínas. Para tal, realizamos (a) uma entrevista com os alunos dos cursos mencionados (pré-teste), (b) dois cursos com duração de três dias para cada turma (LCE e CFBio) e (c) uma entrevista com os mesmos alunos transcorrida uma semana após a realização de cada curso (pós-teste). Os dados obtidos foram de três tipos: registros escritos (desenhos e/ ou esquemas); um ou mais modelos táteis montados com materiais de baixo custo; áudio e imagens oriundos das filmagens das entrevistas. Os registros escritos e os modelos táteis de cada aluno foram fotografados e os áudios das entrevistas transcritos, gerando um documento individual que possibilitou uma análise de conteúdo, permitindo a divisão da amostra em duas categorias: alunos modelizadores e não modelizadores, cada uma com subcategorias próprias. A detecção das representações mentais que os alunos possuíam antes e após o curso sinalizou que a contribuição da sequência didática aplicada no curso para o ensino/aprendizagem do tema proteínas foi positiva, promovendo o aumento do número de alunos modelizadores e possibilitando aos mesmos o aumento do nível de complexidade e sofisticação em suas representações externas (modelos táteis e desenhos) e a evolução e esclarecimento de conceitos antes não compreendidos.Item Análise de robustez em redes complexas(2011-04-20) Barbieri, André LuizA teoria das redes complexas é uma área relativamente nova da Ciência, inspirada por dados empíricos tais como os obtidos de interações biológicas e sociais. Esta área apresenta uma natureza altamente interdisciplinar, de modo que tem unido cientistas de diferentes áreas, tais como matemática, física, biologia, ciência computação, sociologia, epidemiologia e muitas outras. Um dos problemas fundamentais nessa área é entender como a organização de redes complexas influencia em processos dinâmicos, como sincronização, propagação de epidemias e falhas e ataques. Nessa dissertação, é apresentada uma análise da relação entre estrutura e robustez de redes complexas através da remoção de vértices. Para a aplicação deste estudo, foram adquiridas bases de dados de interações de proteínas de quatro espécies, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster e Homo sapiens, como também mapas das malhas de rodovias de sete países, Brasil, Portugal, Polônia, Romênia, Austrália, Índia e África do Sul. Foi estudada a robustez dessas redes através de simulação de falhas e ataques, segundo uma dinâmica de remoção de vértices. Nesse caso, a variação na estrutura das redes devido a essa remoção foi quantificada pelas medidas do tamanho da maior componente conectado, do diâmetro e da média dos comprimentos dos menores caminhos. Ademais, foram utilizadas duas medidas para quantificar a robustez, isto é, a entropia da distribuição das conexões e entropia dinâmica, baseada em cadeias de Markov. Tais medidas foram aplicadas nas redes reais onde se verificou que as espécies mais complexas, como o homem e a mosca, apresentam as redes mais robustas. Com relação aos países, Romênia, Portugal e Brasil apresentam as malhas rodoviárias mais resistentes a perturbações. A correlação entre essas medidas de entropia e as medidas topológicas permitiu identificar que a média do grau dos vizinhos e o coeficiente da lei de potência da distribuição do número de conexões são as medidas que apresentam maior correlação com as medidas de entropia. Tal resultado sugere que a presença de conexões alternativas entre os vizinhos dos vértices removidos favorece a resiliência das redes, pois tendem a minimizar as perturbações causadas pelas remoções. No caso das malhas rodoviárias, foi proposta uma nova medida de acessibilidade e esta se mostrou altamente correlacionada com a entropia dinâmica. Nesse caso, verificou-se que as cidades localizadas no litoral e nas fronteiras dos países são as que menos contribuem para robustez das redes de rodovias. Desse modo, os resultados obtidos sugerem que o planejamento do sistema de transporte de um país deve priorizar o investimento em infra-estrutura rodoviária próximo das cidades com menor acessibilidade, de forma a torná-las mais acessíveis, visando melhorar o transporte de mercadorias e pessoas. Os métodos aqui propostos permitem identificar tais cidades. Ademais, na análise de redes de proteínas, os resultados obtidos podem auxiliar no desenvolvimento de novos modelos de redes, bem como entender os mecanismos evolutivos que priorizam a robustez dos organismos.Item Estudos moleculares das enzimas Fosfoseril-tRNA sintease de Trypanosoma brucei e Leishmania major e Seril-tRNA sintease de Trypanosoma brucei(2009-08-07) Evangelista, Jaqueline PesciuttiO estudo do processo de tradução no metabolismo celular atrai o interesse de vários grupos, em particular, o estudo do 21o aminoácido, a selenocisteína. A incorporação da selecisteína foi descrita em Escherichia coli e recentemente em eucariotos. O primeiro passo desta via é iniciado pela Seril-tRNA Sintetase que aminoacila o Ser-tRNASec (SelC) com uma serina. Em E. coli, o segundo passo é realizado pela Sec-sintetase (SelA) que remove o grupo hidroxil da cadeia lateral da serina, formando um intermediário aminoacrilil. Este serve como aceptor de seleno-fosfato gerando a selenocisteína. Em eucariotos, o processo análogo é realizado pela PSTK e pela SepSecS, que fosforila e seleniza a serina respectivamente. Interessados nesta parte da via, iniciamos estudos moleculares das enzimas Fosfoseril-tRNA Kinase de Trypanosoma brucei e Leishmania major e Seril-tRNA Sintetase de Trypanosoma brucei. Para o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de T. brucei não foi possível obter um clone sem mutação. Já o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de L. major foi clonado em vetor pET28 e a enzima foi expressa em células de E. coli porém com baixo rendimento impedindo a continuidade dos experimentos planejados. Portanto passou-se a investigar a enzima envolvida no primeiro passo da via, no caso, a Seril-tRNA Sintetase de T. brucei. Esta já se encontrava clonada e expressando em E. coli na fração solúvel. A proteína recombinante foi purificada com precipitação com 60% de sulfato de amônio e resinas de hidrofobicidade e de afinidade por níquel. Experimentos de gel nativo, DLS e fluorescência de anisotropia revelaram que, após a purificação, a enzima permanece estável e livre de agregações, possuindo um raio hidrodinâmico de 4,32nm e massa molecular de 110kDa. Acima de 150nM de proteína, ela encontra-se inteiramente na forma dimérica. Estabelecidos estes parâmetros, informações sobre a ligação com o Ser-tRNASec poderão ser obtidos a partir da técnica de anisotropia de fluorescência visto que experimentos iniciais realizados com a SerRS adicionando-se o Ser-tRNASec mostraram-se promissores.Item VRMol - um ambiente virtual distribuído para visualização e análise de moléculas de proteínas.(2009-06-02) Rodello, Ildeberto AparecidoEste trabalho utiliza conceitos de Realidade Virtual e Sistemas Distribuídos para desenvolver um Ambiente Virtual Distribuído para visualização e análise de moléculas de proteínas, denominado VRMol. O sistema foi implementado com a linguagem Java, incluindo as APls Java 3D e Java RMI, visando permitir que pesquisadores geograficamente dispersos troquem informações de uma maneira rápida e eficiente, acelerando a pesquisa e discussão remotas. Assim, foram desenvolvidos uma interface gráfica com Java 3D e um conjunto de métodos para troca de mensagens de acordo com o modelo de comunicação cliente/servidor, com Java RMI. Além disso, o sistema também permite a utilização de alguns dispositivos de entrada não convencionais como joystick e luvas.Item Estudos moleculares das enzimas envolvidas na biossíntese de selenocisteína em Trypanosoma brucei e Leishmania major(2008-09-09) Rodrigues, Elisandra MárciaUmas das principais formas biológicas de incorporação do selênio é na forma de um aminoácido denominado selenocisteína (Sec, U), que é incorporado co-traducionalmente ao polipeptídio nascente em posições específicas do códon UGA, que normalmente é reconhecido como códon de parada. A incorporação de selenocisteína em E. coli já está completamente esclarecida, com a participação dos genes que codifica para selenocisteína sintase (SELA), seril-tRNA sintetase (SerRS), um tRNASec específico (SELC), selenofosfato sintetase (SELD) e um fator de elongação próprio (SELB). Entretanto em eucariotos não há homólogos para SELA e existem evidências de haver a necessidade de dois passos enzimáticos que substituem a atividade desempenhada por SELA, com uma fosforilação da serina seguida de uma selenilação através das enzimas Fosfo-Seril-tRNASec Kinase (PSTK) e Sep-tRNA:Sec-tRNA sintase (SepSecS), respectivamente. A via de biossíntese e incorporação de selenocisteína é muito estudada em alguns organismos, mas ainda pouco explorada em Kinetoplastida. Nesse sentido, realizaram-se estudos moleculares das enzimas envolvidas nessa via, mais especificamente em Trypanosoma brucei e Leishmania major. Foram identificados o elemento SECIS na região 3´ do mRNA que atua no reconhecimento do códon UGA interno e, em fase de leitura na inserção de selenocisteína em Leishmania major e Leishmania infantum; a incorporação de Se75 em proteínas de Leishmania; a ocorrência do tRNASec em Trypanosoma e Leishmania e, adicionalmente todos os genes necessários para a síntese de selenocisteína: SELB, SELD, PSTK e SECp43. Foram obtidos clones dos genes selB e selD em vetor de expressão pET28a(+) e as proteínas foram expressas em bactérias Escherichia coli cepa BL21 (DE3). A proteína recombinante SELD foi purificada em cromatografia de afinidade e seu pI e massa molecular foram determinados usando as técnicas de sistema Phast de eletroforese e gel nativo. As proteínas SELB, SELD, SECp43 e Seril tRNA sintetase foram imunolocalizadas no citoplasma de células nativas de T. brucei. Uma nova metodologia \"PTP tagging\" foi utilizada para estudos de interação protéica com uso de proteínas alvos SECp43, SELB e PSTK na busca de novas proteínas ligantes na via de selenocisteínas em T. brucei. Futuras investigações moleculares e estruturais das enzimas envolvidas na via de selenocisteína em Kinetoplastida poderão trazer informações relevantes no entendimento da biossíntese desse aminoácido, assim como possibilitar o desenvolvimento de inibidores específicos visando o tratamento de doenças causadas pelos parasitas Trypanosoma brucei e Leishmania major.