Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Busca e caracterização de inibidores da enzima DacA de Staphylococcus aureus(2016-10-21) Meneghello, RaphaelRecentemente, uma molécula baseada em nucleotídeos, a adenosina monofosfato dimérica cíclica (c-di-AMP), foi identificada em várias bactérias patogênicas, ganhando rapidamente o status de um sinalizador central no controle de diversos processos bacterianos essenciais, tais como transporte iônico e vigilância a danos no DNA. Em Staphylococcus aureus, por exemplo, o c-di-AMP é essencial para homeostase da parede celular e resistência aos estresses ambientais. A biossíntese de c-di-AMP envolve a condensação de duas moléculas de ATP, catalisadas por enzimas que contenham o domínio DAC (diadenilato ciclase). Especialmente em S. aureus, somente uma ciclase (DacA) é responsável pela síntese desse segundo-mensageiro, através da enzima DacA. Recentemente, nosso grupo determinou a estrutura da DacA de S. aureus, demonstrando a importância do seu estado oligomérico para o mecanismo catalítico. Diferentemente da primeira diadenilato caracterizada, a DisA, uma enzima octamérica, a atividade enzimática da DacA ocorre através do encontro de dois dímeros distintos, formando uma interface cataliticamente competente. Dadas essas características, o foco desse trabalho foi a busca de novos inibidores para a DacA, através de triagens em larga escala (HTS), triagem cristalográfica por fragmentos e docagem molecular. Foram encontrados 30 compostos com atividade inibitória nos ensaios de HTS, 15 compostos derivados de fragmentos da triagem cristalográfica e construída uma biblioteca de 480 compostos docados virtualmente no sítio ativo. Os compostos encontrados na triagem cristalográfica foram caracterizados com respeito ao seu valor de IC50 frente à atividade enzimática. O composto AN-584/43409544 se demonstrou bastante promissor, com valor de IC50 de 54 µM. Ainda, um análogo desse composto foi encontrado na interface dimérica da DacA nos estudos cristalográficos, o que mostra um possível sítio alostérico para o desenvolvimento e busca de inibidores. Os resultados gerados nesse projeto podem servir de base para estudos futuros e desenvolvimento de novos antibióticos, que em combinação com os tratamentos atualmente disponíveis pode levar ao controle das infecções até mesmo das formas mais resistentes de S. aureus.Item Estudos cinéticos e das relações quantitativas entre a estrutura e atividade de inibidores da purina nucleosídeo fosforilase bovina e de Schistosoma mansoni(2013-12-09) Paula, Caroline Barros Valadão deAs ferramentas computacionais de modelagem molecular e de QSAR estão integradas ao processo de planejamento de fármacos na busca inesgotável por novas moléculas bioativas de elevado interesse terapêutico. O trabalho em Química Medicinal realizado nesta dissertação de mestrado envolveu o estudo das relações entre a estrutura e atividade de inibidores da enzima purina nucleosídeo fosforilase (PNP) bovina e de Schistosoma mansoni. A potência de uma série de inibidores da PNP de S. mansoni foi determinada experimentalmente através da medida de valores de 1C50, empregando um ensaio cinético padronizado e validado. Conjuntos de dados padrões para inibidores da enzima PNP bovina e de S. mansoni foram organizados, contendo os dados de estrutura e atividade correspondentes. Estes conjuntos formaram a base científica para o desenvolvimento dos modelos preditivos de QSAR 2D, empregando o método holograma QSAR. Os modelos finais de HQSAR desenvolvidos possuem alta consistência interna e externa, apresentando bom poder preditivo. Estes modelos, em conjunto com as informações obtidas dos mapas de contribuição de HQSAR, são guias químico-medicinais importantes no planejamento de inibidores mais potentes e seletivos, candidatos a protótipos de novos fármacos na quimioterapia segura das doenças alvo deste trabalhoItem Estudos em biologia estrutural e química medicinal no planejamento de novos inibidores da enzima Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase de Trypanosoma cruzi(2010-04-23) Balliano, Tatiane LucianoA doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e foi descoberta em 1909 por Carlos Chagas. A doença atinge cerca de 18 milhões de indivíduos na região das Américas, causando 50.000 mortes ao ano e deixando mais de 100 mil pessoas sob risco de infecção. Os tratamentos disponíveis foram desenvolvidos ainda na década de 70 apresentando baixa eficácia e fortes efeitos colaterais. Assim, é extremamente importante o desenvolvimento de novos fármacos mais seguros e eficazes para o tratamento da doença de Chagas. Uma importante estratégia que pode ser utilizada para o planejamento de novas moléculas bioativas é o planejamento baseado em um receptor-alvo. Nessa tese o alvo em estudo é a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) que faz parte da via glicolítica do protozoário T. cruzi. Este trabalho compreendeu os estudos estruturais e mecanísticos de quatro complexos cristalográficos da GAPDH na presença de ligantes diferentes. As estruturas obtidas subsidiaram estudos que forneceram informações importantes no planejamento de novos inibidores. Foi elucidado o modo pelo qual os compostos alquilantes iodoacetamida e iodoacetato atuam causando a inativação enzimática e as diferenças existentes nesse processo foram esclarecidas, mostrando que é necessária a expulsão do NAD+ do sítio ativo para que a inativação ocorra por parte do iodoacetamida. Além disso, o mecanismo de nitrosilação por complexos de rutênio foi investigado fornecendo informações que contribuem para o entendimento do mecanismo de inibição enzimática por parte dessa classe compostos. Além disso, a partir de um dos complexos estruturais obtidos, foi possível identificar a localização de um novo sítio alostérico que se forma na superfície da proteína. Essa informação é extremamente importante, pois abre novas perspectivas para o planejamento de novos inibidores mais potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi.Item Planejamento racional de novos agentes quimioterápicos: Identificação e estudos cinéticos de novos inibidores da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal de Trypanosoma cruzi(2009-04-28) Zottis, AdersonAs doenças negligenciadas são conseqüências marcantes do subdesenvolvimento que atinge diversas regiões do planeta. Dentre estas, destaca-se a Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, a qual afeta aproximadamente um quarto da população da América Latina e para qual os fármacos utilizados apresentam baixa eficácia, toxidez e sérios efeitos colaterais. Este quadro é agravado pela emergência de cepas resistentes, o que indica a grande necessidade de desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos contra esta doença. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da via glicolítica do T. cruzi é um alvo macromolecular interessante devido ao seu papel essencial no metabolismo de tripanossomatídeos. Constitui o objetivo desta tese o desenvolvimento, a padronização e a validação de ensaios enzimáticos para a realização de extensivas triagens bioquímicas de modo a contribuir para a identificação de novos inibidores da GAPDH pertencentes a diversas classes químicas. Os compostos estudados são provenientes de síntese orgânica e de complexos inorgânicos de Rutênio, bem como de origem natural. Paralelamente, a realização do ensaio virtual em larga escala a partir de uma base de dados dirigida e da estrutura da GAPDH de T. cruzi resultou na identificação de um inibidor inédito da proteína alvo. Estudos do mecanismo de ação enzimático levaram à elucidação da modalidade de alguns inibidores identificados nesse estudo.Item Estudos das relações quantitativas entre a estrutura e atividade de uma série de inibidores da protease do vírus HIV-1(2009-04-17) Ferreira, Leonardo Luiz GomesA Protease do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1 PR, EC 3.4.23.16) é um alvo macromolecular de grande importância no desenvolvimento de fármacos na terapia da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). As maiores indústrias farmacêuticas do mundo concentram inúmeros esforços em estudos acerca desta proteína, que desde a introdução do saquinavir (Invirase®) na terapêutica em 1995, tem se mantido como um alvo fundamental para a descoberta de novos fármacos anti-HIV. A protease do vírus HIV-1 possui uma história rica de enorme sucesso no processo de descoberta e desenvolvimento de fármacos. A Química Medicinal moderna, de forte caráter multidisciplinar, fornece um arsenal de alternativas e estratégias racionais úteis no processo de planejamento de novos fármacos. Uma das tecnologias muito empregadas com sucesso é o estudo das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR) para conjuntos de dados padrões. Os estudos de QSAR visam identificar e quantificar no complexo campo de modelagem as relações entre a estrutura e atividade de uma série de moléculas. Na presente dissertação de mestrado, foram realizados estudos de QSAR bi- (2D) e tridimensionais (3D) empregando, respectivamente, as técnicas holograma QSAR (HQSAR) e a análise comparativa dos campos moleculares (CoMFA), visando à geração de modelos preditivos para um conjunto de inibidores da protease do HIV-1. Os modelos gerados, associados às informações obtidas pelos mapas de contribuição 2D e de contorno 3D, são guias químico-medicinais úteis no planejamento de novos inibidores mais potentes e seletivos da protease do HIV-1.Item Identificação de novos inibidores da migração celular em células de câncer de mama e próstata(2009-01-30) Stevanatto, Karime BittarCâncer é a proliferação descontrolada de células anormais do organismo. As células cancerosas podem se transferir para outras partes do corpo onde passam a crescer e substituir o tecido sadio, num processo conhecido como metástase. De um total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo em 2007, o câncer foi responsável por 7,6 milhões. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo, sendo o mais comum entre as mulheres. A cada ano, cerca de 20% dos novos casos de câncer em mulheres são de mama. No que diz respeito a valores absolutos, o câncer de próstata é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo e o mais prevalente em homens, representando cerca de 10% do total. As principais formas de tratamento são a cirurgia, quimioterapia, radioterapia, hormonioterapia, imunoterapia e as terapias-alvo. Os tratamentos quimioterápicos e radioterápicos, principalmente, possuem baixa seletividade em sua ação frente a células malignas e benignas. O presente trabalho de dissertação tem como objetivo o desenvolvimento de testes in vitro, como o wound healing e o de migração, empregando células de adenocarcinoma mamário humano (MDA-MB-231) e de câncer de próstata humano (DU-145), além da triagem biológica de compostos químicos visando à identificação de novos candidatos a inibidores do processo de migração celular (metástase). Os protocolos experimentais foram estabelecidos e padronizados com sucesso, fornecendo resultados reprodutíveis, confiáveis e validados. Após extensivas triagens biológicas, duas classes de candidatos a inibidores foram identificadas.Item Planejamento de inibidores da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi: biologia estrutural e química medicinal(2008-06-10) Guido, Rafael Victório CarvalhoA Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, atinge cerca de um quarto da população da América Latina. Os fármacos disponíveis para o tratamento desta doença são inapropriados, apresentam baixa eficácia e sérios efeitos colaterais que limitam o seu uso. Esse grave panorama torna urgente a descoberta de novos agentes quimioterápicos para o tratamento seguro e eficaz da doença. A via glicolítica é principal forma de obtenção de energia de tripanosomatídeos. Um alvo molecular atrativo desta via bioquímica que desempenha papel essencial no controle do fluxo glicolítico do Trypanosoma cruzi, a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), foi selecionada neste trabalho de Tese para estudos em biologia estrutural e química medicinal visando à identificação e planejamento de novos inibidores enzimáticos. Neste contexto, triagens biológicas resultaram na identificação de compostos de origem natural e sintética com atividade inibitória in vitro frente à GAPDH de T. cruzi, ampliando a diversidade química de moduladores seletivos deste alvo. Estudos cinéticos e estruturais demonstraram o comportamento não cooperativo entre os sítios ativos da enzima GAPDH de T. cruzi em relação à interação com o cofator NAD+, fornecendo importantes evidências mecanísticas e estruturais para uma melhor compreensão das bases moleculares envolvidas no processo de reconhecimento molecular. Os estudos das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR 2D e QSAR 3D) resultaram na geração de modelos com elevada consistência estatística interna e externa, além de alto poder preditivo da propriedade-alvo. Além disso, estudos de modelagem molecular e de QSAR 3D revelaram aspectos estruturais relevantes para o planejamento de inibidores seletivos da enzima GAPDH de tripanosomatídeos. Por fim, uma estratégia de triagem virtual baseado na estrutura do receptor foi empregada para a identificação de novos inibidores da GAPDH de T. cruzi, consistindo, entre outros, na aplicação de filtros hierárquicos sucessivos envolvendo restrições farmacofóricas e estudos de docagem molecular que resultaram na seleção de 35 candidatos a inibidores da enzima-alvo. Os trabalhos integrando estudos em química medicinal e biologia estrutural apresentados nessa Tese de Doutorado significam importantes contribuições no desenvolvimento de bases científicas sólidas para o planejamento de novos inibidores potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi, um alvo molecular de alta prioridade em nosso grupo de pesquisa.Item Planejamento racional de inibidores da purina nucleosídeo fosforilase de Schistosoma mansoni(2008-04-14) Postigo, Matheus PereiraAs doenças tropicais têm sido alvo de constantes pesquisas nos últimos anos, em diversos centros em todo o mundo. A procura por novos tratamentos eficazes contra estas desordens estimula a identificação de novos alvos moleculares. A esquistossomose é uma doença parasitária crônica, que afeta cerca de 200 milhões de indivíduos em todo o mundo, causada pelo platelminto trematodo do gênero Schistosoma. No Brasil, a única espécie encontrada é o Schistosoma mansoni. Neste trabalho de mestrado, a enzima purina nucleosídeo fosforilase (PNP, EC 2.4.2.1) do parasita Schistosoma mansoni foi selecionada como alvo molecular para a identificação de novos inibidores e sua caracterização cinética através de potência biológica, seletividade e mecanismo de ação. Adicionalmente, dois complexos cristalográficos foram obtidos na presença de inibidores potentes da PNP, tornando-se assim parâmetros para a modelagem molecular empregando a técnica de docagem. Os estudos computacionais permitiram boa compreensão das interações intermoleculares, fornecendo as bases para um estudo detalhado das relações entre a estrutura e atividade destes compostos. Esse conjunto de informações será de grande utilidade nas etapas de planejamento de novas moléculas bioativas mais potentes e seletivas, candidatas a agentes quimioterápicos contra a esquistossomose.