Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)

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Assunto: search.filters.subject.Hidrólise enzimática

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    Otimização de estratégias de pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar para produção de etanol de segunda geração via hidrólise enzimática
    (2015-04-28) Espirito Santo, Melissa Cristina do
    Atualmente, o aumento da preocupação com a sustentabilidade ambiental, alinhado às perspectivas de esgotamento das reservas de petróleo, tem direcionado às buscas por fontes renováveis de energia. O emprego de resíduos agroindustriais, principalmente de usinas sucroalcooleiras destaca-se como sendo uma alternativa para a produção de etanol de segunda geração. Dentre as metodologias aplicadas para disponibilização dos açúcares fermentescíveis está a hidrólise enzimática. Ainda, para facilitar esta etapa e torná-la mais acessível, submete-se, previamente, o material lignocelulósico a um pré-tratamento, com o objetivo de contribuir com a susceptibilidade da celulose a ataques enzimáticos. No entanto, devido à complexidade das estruturas lignocelulósicas, os processos de hidrólise e pré-tratamento precisam se tornar mais eficientes e economicamente viáveis. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar e caracterizar os pré-tratamentos hidrotérmico e organossolve (etanol 50%), isoladamente, e estes combinados em diferentes condições, assim como a influência destes procedimentos na estrutura e composição da biomassa, bem como na hidrólise enzimática. Os resultados demonstraram que os pré-tratamentos hidrotérmicos a 160 ºC nas condições analisadas foram pouco efetivos na melhora do acesso enzimático durante a etapa de hidrólise, pois atuaram de maneira branda na parede celular, pouco solubilizando a hemicelulose e lignina, conforme as análises físicas comprovaram. Os tratamentos combinados hidrotérmico 30 min e 60 min a 160 ºC seguidos pelo organossolve por 150 min apresentaram semelhança morfológica e alta solublização da lignina e hemicelulose, justificando os valores de hidrólise. Nossos resultados abrem perspectivas de novos estudos que visam a otimização dos pré-tratamentos hidrotérmicos e organossolve, além da compreensão das alterações composicionais e morfológicas que levam à melhoria da hidrólise enzimática na biomassa lignocelulósica.
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    Caracterização bioquímica e biofísica da enzima β-glicosidase Bgl1 de Aspergillus niger e avaliação de potenciais biomassas para produção de bioetanol
    (2013-10-11) Lima, Marisa Aparecida de
    A busca por novas tecnologias que visam à produção de biocombustíveis renováveis, especialmente bioetanol e outros biomateriais, tem se intensificado nos últimos anos. Há um interesse mundial crescente na limitação dos impactos ambientais e mudanças climáticas através da substituição de produtos petroquímicos por análogos ambientalmente corretos, a fim de alcançar uma economia mais sustentável. Além disso, as plataformas biorrefinarias lignocelulósicas necessárias para a produção de bioetanol representam uma oportunidade de estimular novos mercados para o setor agrícola e aumentar os empregos locais, contribuindo para o desenvolvimento das economias emergentes. No entanto, a maioria dos processos de conversão são baseados no conhecimento empírico, exigindo estudos mais aprofundados sobre os fatores envolvidos na hidrólise enzimática da celulose, tais como características biomassas, a otimização da etapa de pré-tratamento, bem como das atividades das enzimas e seus mecanismos de ação. Assim, com o objetivo de contribuir para a viabilização e implantação das tecnologias de produção do etanol lignocelulósico, na primeira parte deste trabalho de doutorado, foi realizada a purificação da β-glicosidase do fungo Aspergillus Níger (NaBgl1), principal enzima do coquetel comercial Novozymes 188, e sua caracterização bioquímica e biofísica. As análises de espalhamento de raios-x a baixo ângulo revelaram uma organização multidomínios desta enzima, com uma estrutura molecular de girino semelhante ao encontrado para as celulases. A sua estrutura é composta por um domínio catalítico N-terminal e um domínio fibronectina de tipo III (FnIII) na região C-terminal, conectados entre si por um longo linker com uma inserção de 100 resíduos de aminoácidos numa conformação estendida. Apesar desta estrutura molecular incomum, os ensaios de eletroforese capilar revelaram um perfil processividade característico de β-glucosidases, e os ensaios enzimáticos confirmaram, também, a ausência de atividade em substratos poliméricos. Nos ensaios adosrção com diferentes compostos poliméricos, a enzima β-glicosidase mostrou uma capacidade de adsorção elevada em lignina. Os mecanismos de ligação FnIII-lignina foram elucidados por simulações de dinâmica molecular, que confirmaram apresença de vários sítios de ligação à lignina no domínio FnIII da enzima. Como segunda parte da presente tese, diferentes biomassas, como bagaço de cana, resíduos de casca de eucalipto e gramíneas (Panicum maximum, Pennisetum purpureum e Brachiaria brizantha) foram submetidas a vários métodos de pré-tratamento (ácido diluído, alcalino, sulfito e água quente) em diferentes condições de tratamento e avaliadas quanto ao seu potencial para a produção de bioetanol. As biomassas in natura e pré-tratadas foram caracterizadas quanto à sua composição química por métodos cromatográficos, ressonância magnética nuclear e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier; o índice de cristalinidade das amostras foi determinado por método químico e difração de raios-x; as análises morfológicas foram realizadas por microscopia eletrônica de varredura; e os resultados da caracterização foram correlacionados com os perfis de sacarificação enzimática encontrados para cada uma delas.
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    Caracterização bioquímica, biofísica e estrutural da Celobiohidrolase I de Trichoderma harzianum envolvida na hidrólise da biomassa lignocelulósica
    (2012-12-12) Colussi, Francieli
    Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI.