Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Estudos estruturais da SEPT8 e análise de suas interações com SEPT5 e SEPT7(2014-08-06) Morais, Sinara Teixeira do BrasilSeptinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais formam filamentos e estruturas de maior nível de organização. Tais filamentos, além de se mostrarem importantes durante a citocinese também podem estar envolvidos em outros processos celulares tais como determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. As septinas, inicialmente descobertas em Saccharomyces cerevisiae, já foram identificadas também em fungos, algas-verdes, mamíferos, porém nunca em plantas. Tipicamente, septinas apresentam três domínios estruturais compostos por um domínio central de ligação ao GTP flanqueado por um N-terminal variável e um C-terminal que pode conter sequências do tipo coiled-coil. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do domínio de ligação a GTP da septina 8 humana (SEPT8G) por meio de estudos biofísicos. Nesse sentido, SEPT8G foi eficientemente produzida em E. coli, tendo seu estado dimérico em solução confirmado por cromatografia de exclusão molecular. Diferentemente das outras septinas já reportadas, mesmo dimérica a SEPT8G apresentou-se na forma apo. Ensaios de atividade GTPásica foram realizados, confirmando a incapacidade dessa septina em hidrolisar o GTP. Ainda, análises de estabilidade térmica por Dicroísmo Circular revelaram que a presença do íon magnésio leva à diminuição de sua estabilidade estrutural. Baseando-se em resultados prévios de interação obtidos pela técnica do duplo-híbrido em leveduras, estudos voltados à análise da interação entre as septinas 7 e 8 e, posteriormente, entre as septinas 5, 7 e 8 foram realizados. A co-purificação do complexo formado pelas septinas 7 e 8 mostrou-se dependente da região C-terminal completa de SEPT7 de modo que, quando ausente, a interação mostrou-se expressivamente prejudicada. Já o complexo formado pelas septinas 5/7/8 foi obtido contendo as três proteínas em frações equimolares e solúveis, disponibilizando assim um novo heterocomplexo de septinas para ensaios funcionais e estruturais.Item Caracterização estrutural e funcional de septinas de Schistosoma mansoni(2014-01-07) Zeraik, Ana ElizaSeptinas são proteínas pertencentes à família das GTPases que estão envolvidas em uma variedade de funções celulares. Verificamos através de análises bioinformáticas que Schistosoma mansoni, um dos principais agentes etiológicos da esquistossomose, possui quatro genes que codificam septinas (SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2). O objetivo deste trabalho foi a produção heteróloga das proteínas codificadas por estes genes, visando estudos estruturais e funcionais das mesmas. As septinas SmSEPT5 e SmSEPT10 foram expressas em sistema recombinante e foi possível a obtenção de formas solúveis destas proteínas. Experimentos de gel filtração e cross-linking mostraram que elas são diméricas em solução e estáveis em ampla faixa de pH, embora agregados proteicos tenham sido observados com o aumento da temperatura. Ambas as proteínas foram capazes de ligar GTP e GDP, embora apenas SmSEPT5 tenha apresentado atividade GTPásica. Mg2+ se mostrou essencial para a ligação de GTP a ambas as proteínas, enquanto a ligação do GDP foi independente da presença deste cofator. Ensaios de cristalização com o domínio GTPase de SmSEPT10 resultaram em cristais de ótima qualidade cuja difração resultou na obtenção da estrutura com melhor resolução alcançada até o momento para septinas: 1.9 Å para a forma ligada a GDP e 2.1 Å para a forma ligada a GTP. A análise da sobreposição das estruturas obtidas resultou na observação do deslizamento de uma fita β em relação às demais, que acreditamos estar envolvido com o mecanismo de associação destas proteínas à membranas. Um sistema de coexpressão foi construído em que SmSEPT5, SmSEPT10 e SmSEPT7.2 foram coexpressas e copurificadas, resultando na verificação da formação de hetero-oligômeros e filamentos por estas proteínas. Tratamento de diversas fases do ciclo de vida do parasito com um composto (FCF) que afeta a dinâmica de filamentos de septina, resultou em um fenótipo reversível de paralisia no parasito. Estudos de imunolocalização revelaram a colocalização de septinas e actina em fibras musculares do parasito, sugerindo que a interação entre filamentos de septina e actina pode ter um papel importante nas funções motoras do parasita. A imunolocalização revelou ainda a presença de septinas em placas epiteliais ciliadas de miracídios, células germinativas de miracídios e esporocistos e protonefrídios de cercárias. Os resultados apresentados aqui constituem a primeira descrição de septinas em platelmintos e nos possibilitam o estabelecimento de correlações estruturais e funcionais entre septinas de S. mansoni e complexos análogos de septinas de outros organismos, contribuindo para a elucidação da função desta família de proteínas.