Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Fluorescence lifetime spectroscopy for diagnosis of clinically similar skin lesions(2016-11-28) Nogueira, Marcelo SaitoThe fluorescence spectroscopy and lifetime analysis in biological tissues has been presented as a technique of great potential for tissue characterization for diagnostic purposes. This potential is due to the main advantages of optical techniques based on fluorescence for diagnosis, which includes the possibility of evaluating the tissue metabolism in situ, without removal and processing of the biological sample, through a fast and non-invasive response. Skin lesions were the target interrogated tissue in the present study. They can be clinically classified into two major groups: pigmented and non-pigmented lesions. In each group, the clinical discrimination of benign and malignant lesions may be a complex task, especially for non-experienced clinicians. When these lesions have clinically similar features, the choice of the treatment modality becomes difficult. In this context, auxiliary diagnostic techniques are very important to improve the diagnostic resolution as well as treatment planning and success. Gold standard for skin diagnosis is obtained with the biopsy and further histological analysis. The information about these features is invasive and time consuming. When using a non-invasive procedure such as fluorescence lifetime measurements, the main interrogated fluorophores are NADH (nicotinamide adenine dinucleotide) and FAD (flavin adenine dinucleotide), biomolecules involved in cellular respiration that may provide information on the metabolism of the cells. To differentiate each skin lesion, it is necessary to take into account the contribution of endogenous fluorophores emission such as collagen and elastin, and the absorption of chromophores such as melanin and hemoglobin. In addition to fluorescence decay analysis considering the contribution of fluorophores and chromophores, a stable and portable system is desired for clinical measurements and interrogation of biological tissue in vivo. In this study, we have assembled, calibrated, and characterized one of the worlds first portable time-resolved fluorescence spectroscopy system for single-point measurements. This system was designed to be robust and user-friendly for clinical applications. The system was calibrated and characterized in vitro before the clinical application. It was used for evaluation of the photoaging process in sun-exposed and non-exposed skin and for discrimination of clinically similar skin lesions. Significant statistical differences were observed for 10 parameters when comparing normal and photoaged skin (students t-test, p < 0.001), and for all combinations of non-pigmented and pigmented lesions when using tri-exponential decay parameters (Wilcoxon rank sum test, p<0.05). Both in vivo measurements showed promising results and have potential for many applications in dermatology, oncology and aesthetics. Next steps include multivariate data analysis and the determination of the diagnostic resolution of fluorescence lifetime spectroscopy. Further investigation of optical processes related to fluorescence decay changes is necessary, since fluorescence lifetime values in biological tissues reported on the literature are very scarce and heterogeneous and not completely understood.Item Desenvolvimento de um sistema de imagem de campo amplo de fluorescência para localização de linfonodo sentinela empregando a indocianina verde(2016-05-09) Govone, Angelo BiasiA fluorescência é uma técnica amplamente empregada na área de diagnóstico médico, com aplicações distintas. Uma de suas aplicações é a detecção de um determinado marcador que pode ser injetado no paciente. A indocianina verde (ICG) é um exemplo de marcador fluorescente que pode ser empregado para auxiliar na identificação do linfonodo sentinela. A excitação é realizada em 780 nm e a emissão detectada ao redor de 850 nm. Tais comprimentos de onda são muito favoráveis para aplicação médica por apresentarem pouca absorção por tecidos biológicos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema de imagens por fluorescência de ICG. Este sistema é basicamente constituído por um dispositivo de iluminação e de aquisição e tratamento de imagem. Dois protótipos foram construídos e testados, um com excitação Laser e o segundo a LED. O dispositivo de iluminação oferece uma iluminação uniforme em uma área de 10 por 15 cm a uma distância de 30 cm. A fluorescência é captada por um sistema composto por duas câmeras perpendiculares uma à outra e um espelho dicroico angulado 45° a ambas, cuja função é separar a imagem por bandas. Uma das câmeras capta a imagem refletida do espelho no espectro visível e a outra capta a imagem transmitida pelo espelho no infravermelho. As imagens obtidas pelas câmeras recebem tratamento em uma rotina desenvolvida em plataforma LabVIEW® para destacar a região com fluorescência sobreposta na imagem sob iluminação branca em tempo real, sendo possível salvar figuras ou vídeos, dependendo da necessidade do operador. O equipamento foi testado no Hospital de Câncer de Barretos em pacientes para ressecção cirúrgica de tumores de cabeça e pescoço e de melanoma e apresentou resultados promissores.Item Utilização de técnicas espectroscópicas no estudo e caracterização de doenças em citros: HLB (greening) e cancro cítrico(2014-09-10) Ranulfi, Anielle CoelhoCom clima diversificado e terras férteis, o Brasil tem vocação natural para o desenvolvimento agropecuário e todas as suas vertentes. Assim, o agronegócio é hoje a principal locomotiva da economia brasileira, representando cerca de um terço do nosso Produto Interno Bruto (PIB). Nesse contexto, o Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do planeta, com destaque para a produção de laranjas. Particularmente, o país lidera a produção mundial de suco de laranja e conta com uma participação de 85% nas exportações deste produto. Porém, um dos principais fatores atuais que restringem os lucros e a expansão da citricultura é o controle fitossanitário. Atualmente, dentre as principais doenças podemos destacar o HLB e o cancro cítrico. Ambas, doenças bacterianas que não têm cura comprometem a produção e desenvolvimento da fruta e levam à morte da árvore. Dessa maneira, o monitoramento destas é fundamental para evitar danos aos frutos e a necessidade da erradicação de plantações inteiras. O presente trabalho avaliou o emprego das técnicas de Espectroscopia de Fluorescência Induzida por Laser (LIFS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Induzido por Laser (LIBS) como forma de diagnóstico destas doenças, se apresentando como uma alternativa às inspeções visuais e ao PCR utilizados atualmente. Para isso, folhas de citros in natura provenientes de plantas sadias, com HLB ou com cancro foram amostradas e medidas com ambos os sistemas. Através do sistema LIFS foi realizado um estudo de precocidade no diagnóstico do HLB. Este sistema fotônico pôde detectar a doença até 21 meses antes do aparecimento dos primeiros sintomas visuais. Foram utilizados classificadores sazonais, criados a partir de Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e conjuntos de calibração previamente avaliados. Quanto ao cancro cítrico e o sistema LIFS, taxas de acerto superiores a 90% foram alcançadas nos melhores casos de validação cruzada dos dados. A diferenciação do cancro e do HLB também foi possível pela mesma técnica ao avaliar um conjunto pequeno de dados, que atingiu uma taxa de acerto de 82%. Através dos espectros obtidos pelo sistema LIBS, avaliou-se as variações nutricionais causadas na planta devido à doença. Por meio de tais variações e métodos de PLSR foi construído um modelo para o diagnóstico de HLB alcançando taxas de acerto da ordem de 75%. Em relação ao cancro cítrico e o sistema LIBS, um estudo preliminar foi realizado, e uma taxa de acerto superior a 90% foi atingida. Por fim, os resultados corroboraram com a ideia inicial de se realizar o diagnóstico do HLB e do cancro cítrico através de técnicas fotônicas. Dentre outras vantagens estas permitem uma análise rápida, in loco, sem a necessidade de preparo de amostra. Além disso, para o HLB, as técnicas fotônicas demonstraram menor sensibilidade à distribuição não homogênea da doença, quando comparada com a técnica de referência (qPCR).Item Imunossensores potenciométricos para a detecção da proteína NS1 do vírus da dengue(2013-08-19) Figueiredo, AlessandraA dengue é uma doença negligenciada que carece de métodos diagnósticos rápidos nos primeiros dias de infecção. São quatro sorotipos diferentes, cuja monitoração é essencial para o controle da ocorrência de casos graves como a dengue hemorrágica. É urgente o desenvolvimento e disponibilização de um dispositivo capaz de suprir essa demanda, de modo que propomos a utilização de imunossensores potenciométricos, devido a facilidade de miniaturização e produção dos dispositivos e seu baixo custo, além da possibilidade de detecção direta (sem marcadores) e simplicidade de manuseio. Dispositivos sensores de pH, como o transistor de efeito de campo de porta estendida e separada (SEGFET) e amplificadores de instrumentação (AI) podem ser utilizados como transdutores de sinal para a reação antígeno-anticorpo, a partir da utilização de materiais não nernstianos, como o ouro, como plataforma sensível. A proteína NS1 do vírus da dengue é um excelente marcador da infecção, pois é secretada em altas concentrações pelo vírus no sangue de pessoas infectadas logo nos primeiros dias, de modo que o sistema preza pelo diagnóstico precoce da doença. Sua detecção é realizada através da imobilização de anticorpos anti-proteína NS1 na plataforma sensível, permitindo sua quantificação através da detecção da alteração local de carga. O eletrodo foi caracterizado por diversas técnicas de microscopia, entre elas de varredura, confocal e de força atômica, além da utilização de espectroscopia de impedância eletroquímica, permitindo um amplo conhecimento da superfície da membrana sensível. Os imunossensores desenvolvidos apresentaram alta sensibilidade, com capacidade de detecção da ordem de ng.mL-1. Na região linear da curva analítica, foram obtidos sensibilidade correspondente a (15.7 ± 4.4) .10-4 μA.μg.mL-1 para o SEGFET e (3.2 ± 0.3) mV.μg.mL-1 para o AI, sendo que este último apresenta uma maior estabilidade de sinal e dispensa a utilização de uma fonte variável de tensão, reduzindo o custo no desenvolvimento de um dispositivo diagnóstico comercial. Estes resultados levaram a um pedido de patente e o prosseguimento do projeto através da miniaturização do sistema e detecção em amostras reais.Item Identificação de lesões de pele por detecção fotodinâmica mediada por ácido aminolevulínico(2012-05-03) Andrade, Cintia Teles deNo Brasil, o câncer de pele não-melanoma é o tipo de câncer mais comum, corresponde a cerca de 95% de todos os tipos de câncer de pele e 25% de todo o tipo de tumor maligno. O diagnóstico precoce permite tratar lesões logo nos primeiros estágios da doença, melhorando as condições do paciente. Assim, é de grande importância desenvolver técnicas para auxiliar o diagnóstico, como a fluorescência marcada. Ela consiste em usar substâncias fotossensíveis como biomarcadores e analisar sua resposta de fluorescência à excitação por luz. O uso do ácido aminolevulínico (ALA) é de interesse para tal, pois apresenta seletividade para formação da protoporfirina IX (PpIX) em células alteradas, substância esta que apresenta boa resposta de fluorescência à excitação por luz (região do UV-Azul). Para um diagnóstico adequado, portanto, é necessário entender melhor o comportamento da luz em meios túrbidos, como a pele. Assim, o objetivo do estudo é investigar fenômenos envolvidos com esta técnica in vitro e in vivo. Para a análise in vitro foi usado um phantom de pele contendo 2% de nanquim, 1% de Lipofundin® e 5% BRIJ-35. Um derivado de porfirinas (Photogem®) foi inserido no interior dessa solução e excitado de formas diferentes para estudar o comportamento da fluorescência, da luz de excitação e de ambas. No ensaio clínico, soluções de ALA (5% e 10%) foram aplicadas em lesões de pele malignas e potencialmente malignizáveis, e em intervalos regulares de tempo (15, 30, 45 e 60 minutos), as imagens de fluorescência foram coletadas com o protótipo de um sistema de diagnóstico por imagem de fluorescência. A diferente atenuação dos comprimentos de onda envolvidos foi quantificada in vitro. Verificou-se que o limitante do diagnóstico é a luz de excitação, sua penetração limitada em meios túrbidos impede que esta chegue à camadas profundas do tecido com uma intensidade suficiente para excitar o centro fluorescente, de modo que a fluorescência emitida possa ser detectada na superfície do tecido. Na investigação in vivo, o ALA proporcionou uma fluorescência marcada que distinguiu significantemente a pele normal da tumoral e as lesões de pele pré-malignas foram identificadas através de sua autofluorescência. A técnica de diagnóstico contribuiu também para a identificação das bordas da lesão, o que é muito importante para um tratamento eficaz.