Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Estudos estruturais e funcionais da única enzima diadenilato ciclase e da única YbbR-like de Staphylococcus aureus: proteínas envolvidas na biossíntese de c-di-AMP(2016-10-31) Mesquita, Nathalya Cristina de Moraes RosoRecentemente, uma nova molécula de sinalização bacteriana, o AMP dimérico cíclico (c-di-AMP) emergiu como um regulador central dos processos fisiológicos essenciais, tais como a homeostase celular, verificação da integridade do DNA e virulência bacteriana, entre outros. O c-di-AMP é produzido a partir da condensação de duas moléculas de adenosina trifosfato (ATP) por proteínas denominadas diadenilato ciclases, que contém o domínio DisA_N, também denominado DAC. Existem 2842 sequências de proteínas que contém o domínio DAC, provenientes de 2386 organismos encontradas no banco de dados Protein Families Database (Pfam). Essas proteínas são divididas em subfamílias sendo as três subfamílias mais abundantes: DacA (69,1%), proteínas de membrana associadas a sinalização intracelular de alterações decorrentes do meio externo; DisA (24,1%), primeira diadenilato ciclase a ser amplamente estudada, é uma proteína intracelular encontrada na forma de octâmeros ativos em solução, a qual, indiretamente, controla a divisão celular através da verificação da integridade do DNA e DacB (5,5%), proteínas citoplasmáticas expressa, particularmente, durante a formação de esporos bacterianos. Uma característica interessante é que a maioria dos organismos contém uma única e essencial proteína com domínio DAC. Os organismos que contém duas ou mais proteínas-DAC, tais como Clostridium e Bacillus spp., são uma exceção. Em Staphylococcus aureus (S. aureus), um patógeno humano oportunista e responsável por inúmeras doenças infecciosas, uma única diadenilato ciclase é encontrada pendurada na porção interna da membrana celular (Sau_DacA). A atividade desta proteína é potencialmente regulada através da interação direta com uma proteína YbbR-like, que contém um domínio sensor extracelular. Sau_DacA conserva todos os elementos-chave de uma diadenilato ciclase bacteriana, e por ser a única presente em S. aureus, revela-se um excelente alvo de estudo para o desenvolvimento de novos fins terapêuticos. No entanto, até o presente momento, existem poucas informações em relação a estrutura proteica, ao mecanismo de síntese de c-di-AMP e regulação do mecanismo de síntese de nucleotídeo destas proteínas, sendo, portanto, neste aspectos que o presente trabalho pretendeu contribuir. Através de uma série de ensaios, estruturais, calorimétricos, espectroscópicos e bioquímicos, aliados a mutações sítio-dirigidas, identificou-se a relevância de uma conformação dimérica para a estabilidade conformacional e térmica para a proteína ser funcionalmente ativa, assim como a importância dos motivos conservados DGA (Aspartato-Glicina-Alanina) e RHR (Arginina-Histidina-Arginina) para a atividade da Sau_DacA. O loop L5 localizado entre o sítio ativo e a interface dimérica mostrou-se relevante, uma vez que nele é encontrado o motivo DGA - de ligação ao ATP - e o mesmo encontra-se estabilizado em uma posição favorável para ligação do ATP, apenas na conformação dimérica da proteína. Nossos resultados aliados a dados da literatura possibilitaram a proposição de um mecanismo de síntese de c-di-AMP que deve ocorrer via encontro face-a-face de dois sítios de ligação de ATP presentes em dímeros proteicos distintos, podendo a taxa de síntese de o nucleotídeo sofrer interferência via interação proteína-proteína com a proteína receptora de sinal Sau_YbbR. Desta forma, contribuímos para uma melhor compreensão da estrutura e função da Sau_DacA, possibilitando o uso desta como alvo para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que é sabido que a biossíntese de c-di-AMP é essencial para a maioria dos patógenos que o sintetizam.Item Busca e caracterização de inibidores da enzima DacA de Staphylococcus aureus(2016-10-21) Meneghello, RaphaelRecentemente, uma molécula baseada em nucleotídeos, a adenosina monofosfato dimérica cíclica (c-di-AMP), foi identificada em várias bactérias patogênicas, ganhando rapidamente o status de um sinalizador central no controle de diversos processos bacterianos essenciais, tais como transporte iônico e vigilância a danos no DNA. Em Staphylococcus aureus, por exemplo, o c-di-AMP é essencial para homeostase da parede celular e resistência aos estresses ambientais. A biossíntese de c-di-AMP envolve a condensação de duas moléculas de ATP, catalisadas por enzimas que contenham o domínio DAC (diadenilato ciclase). Especialmente em S. aureus, somente uma ciclase (DacA) é responsável pela síntese desse segundo-mensageiro, através da enzima DacA. Recentemente, nosso grupo determinou a estrutura da DacA de S. aureus, demonstrando a importância do seu estado oligomérico para o mecanismo catalítico. Diferentemente da primeira diadenilato caracterizada, a DisA, uma enzima octamérica, a atividade enzimática da DacA ocorre através do encontro de dois dímeros distintos, formando uma interface cataliticamente competente. Dadas essas características, o foco desse trabalho foi a busca de novos inibidores para a DacA, através de triagens em larga escala (HTS), triagem cristalográfica por fragmentos e docagem molecular. Foram encontrados 30 compostos com atividade inibitória nos ensaios de HTS, 15 compostos derivados de fragmentos da triagem cristalográfica e construída uma biblioteca de 480 compostos docados virtualmente no sítio ativo. Os compostos encontrados na triagem cristalográfica foram caracterizados com respeito ao seu valor de IC50 frente à atividade enzimática. O composto AN-584/43409544 se demonstrou bastante promissor, com valor de IC50 de 54 µM. Ainda, um análogo desse composto foi encontrado na interface dimérica da DacA nos estudos cristalográficos, o que mostra um possível sítio alostérico para o desenvolvimento e busca de inibidores. Os resultados gerados nesse projeto podem servir de base para estudos futuros e desenvolvimento de novos antibióticos, que em combinação com os tratamentos atualmente disponíveis pode levar ao controle das infecções até mesmo das formas mais resistentes de S. aureus.