Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Estudos biofísicos e estruturais de xilose isomerases para produção de etanol de segunda geração(2012-12-10) Reis, Caio Vinicius dosA demanda por combustíveis baseados em recursos renováveis é alta nos dias de hoje e tende a aumentar bastante no futuro. No Brasil, indústrias de biocombustíveis produzem principalmente etanol a partir cana-de-açúcar. A biomassa lignocelulósica, compreendendo resíduos de culturas, resíduos florestais, sólidos urbanos, é explorada como um elevado potencial secundário na produção de biocombustíveis, mesmo na categoria de subprodutos, eliminando assim os usos competitivos. Para tornar a produção de etanol de segunda geração a partir da cana-de-açúcar economicamente sustentável, é imprescindível utilizar fração hemicelulósica da biomassa, o que corresponde de 20% a 25%, sendo a xilose seu principal componente. Saccharomyces cerevisiae não fermenta xilose, entretanto, xilulose pode ser fermentada. Portanto a busca e o estudo de enzimas que procedem com a conversão de xilose em xilulose (em condições sinérgicas às da fermentação alcoólica) se torna de extrema importância no que se refere ao aproveitamento da hemicelulose para a geração de etanol de segunda-geração. Xilose isomerases (XI) de três microorganismos diferentes (de Xanthomonas campestris pv. Campestris [Xyl_Xcc], Bifidobacterium adolescentis [Xyl_Bad] e de Lactobacillus crispatus [Xyl_LCr]) são o objeto de estudo deste projeto. A partir do conteúdo genômico desses três microorganismos, foi realizada a amplificação do gene xylA (que codifica para XI), via Clonagem Independente de Ligação/Ligase (do inglês, LIC) e clonagem em vetor de expressão pPROEX HTa adaptado para LIC, e superexpressão em Escherichia coli BL21 (DE3). As XIs foram então extraídas e purificadas por cromatografia de afinidade com metal quelado, seguida de cromatografia de exclusão molecular. Nessa etapa, as massas moleculares e raios hidrodinâmicos (RH) foram estimados, tanto por cromatografia de exclusão molecular quanto em gel nativo, revelando que Xyl_Xcc e Xyl_Bad se apresentam diméricas enquanto Xyl_LCr monomérica. Subseqüentemente, foram realizados testes de atividade em diferentes condições (pHs e temperaturas), para mapear condições ótimas de reação. A atividade ótima de ambas Xyl_Xcc e Xyl_Bad foi ao redor do pH 5,5, com temperaturas ótimas girando em torno de 60°C. Xyl_LCr se mostrou sem atividade. Além disso, o monitoramento da estabilidade térmica das XIs foi realizado através de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). As estabilidades térmicas da estrutura secundária e da estrutura terciária como um todo parecem aumentadas com a elevação do pH. Entretanto, isso não condiz com perfil de atividade dessas enzimas, visto que a atividade ótima se apresentou deslocada para valores de pHs ácidos. Modelos de baixa resolução obtidos por SAXS foram alinhados e sobrepostos às estruturas de alta resolução de proteínas homólogas, revelando um bom ajuste da forma tetramérica para Xyl_Bad e Xyl_Xcc e monomérica para Xyl_LCr. Portanto, levanta-se a hipótese da dissociação do tetrâmero em dímeros, possivelmente causado pela interação (mecânica) com o sistema de emaranhados do gel nativo e com os poros da coluna de exclusão molecular. Foram obtidos cristais de Xyl_Bad e Xyl_Xcc, e esses foram submetidos à difração de raios-X, revelando a presença de um domínio conservado na maioria das XIs reportadas, formado por um barril α⁄β (N-terminal). As estruturas estão em fase avançada de refinamento. Ao final, são propostos estudos futuros que complementem os resultados apresentados, e que poderão comprovar as hipóteses criadas a partir deste trabalho.Item Estudos físico-químicos e bioquímicos de uma proteína de 21 kDa do Trypanosoma cruzi(2012-05-07) Moreira, Heline Hellen TeixeiraA proteína P21 do Trypanosoma cruzi participa no processo de infecção da célula hospedeira, desse modo é de grande importância: elucidar as vias de sinalização induzidas pela proteína, bem como caracterizar a nível molecular e estrutural a P21. O que vai auxiliar no entendimento da função biológica da P21 e sua participação no processo de infecção. A P21 recombinante é expressa Escherichia coli em sua maioria na fração insolúvel. Visando aumento de proteína na fração solúvel, foi realizada a clonagem do gene da P21 em vetor pSMT3, bem como testes de expressão subsequentes em diferentes cepas de expressão de E. coli, em vetor pET-28 e pSMT3 e variadas condições de expressão e lise celular. Desse modo obtiveram-se as condições que permitissem uma maior concentração da P21 na fração solúvel. A expressão foi realizada no vetor pET-28, cepa BL21, a 37°C com meio 2xYT a 0.5 mM de IPTG, utilizando a técnica de sonicação como lise. A P21 foi purificada em cromatografia de afinidade e posteriormente em coluna de exclusão molecular. Foram realizados estudos de modelagem por homologia levaram a elaborar a hipótese de que a P21 tem a função de inibidor de serinoprotease do tipo kunitz. Posteriormente essa hipótese foi confirmada com ensaios de avaliação da atividade inibitória da P21 frente à tripsina, quimiotripsina e elastase neutrofílica, o qual a P21 mostrou capaz de inibir a elastase neutrofílica. Estudos com espalhamento dinâmico da luz (DLS) revelaram que as amostras testadas de P21 contém diferentes concentrações de agregados de alto peso molecular em todos os pHs avaliados. Outras medidas foram realizadas para avaliar o estado de agregação da P21 de acordo com a temperatura e verificou-se que entre 32-52 °C, a proteína apresenta menor raio hidrodinâmico, indicando menor agregação nesse intervalo. Estudos de dicroísmo circular revelaram que a P21 apresenta por volta de 20% de α hélice, 32% de folha-β, 22% de volta e 23 % estrutura randômica. De acordo com a curva de desnaturação referente ao espectro de CD obtido, a P21 se mostra desnaturada a partir de 64°C.Item Thi1, uma proteína envolvida na síntese de tiamina em Arabidopsis thaliana: análises estruturais do mutante Thi1 (A140V)(2011-10-05) Garcia, Assuero FariaA forma ativa da vitamina B1, tiamina pirofosfato (TPP), é um cofator indispensável para certas enzimas que atuam no metabolismo de carboidratos e aminoácidos. Sua biossíntese se dá pela formação independente de suas partes componentes pirimidina e tiazol. Em procariotos a via de síntese para vitamina B1 já foi esclarecida, entretanto em eucariotos ainda existem ainda algumas lacunas a serem preenchidas. Em Arabidopsis thaliana a proteína Thi1 é possivelmente a responsável pela síntese do motivo tiazólico, uma vez que um composto relacionado a TPP foi encontrado em sua estrutura. Neste trabalho, Thi1 e seu mutante natural Thi1(A140V), o qual é responsável pela auxotrofia para tiamina numa linhagem mutante de A. thaliana, foram estudados com intuito de verificar a influência da mutação pontual na estrutura e na atividade de Thi1. As proteínas foram produzidas em E. coli e análises biofísicas usando anisotropia de fluorescência e Dicroísmo Circular (CD) mostraram diferenças consideráveis na estabilidade protéica. Estudos de desnaturação mostraram diferenças na temperatura de transição (Tm), de cerca de 4 ºC maior para Thi1, e na concentração de guanidina na qual metade das proteínas estavam desnaturadas, de 0,42 M para Thi1 e 0,24 M para Thi1(A140V). Os dados de anisotropia de fluorescência obtidos a partir da desnaturação térmica também confirmaram a maior instabilidade de Thi1(A140V) frente a Thi1. Para avaliar a presença e caracterizar o provável precursor de TPP em Thi1(A140V), foram também realizados ensaios de absorção, CD e infra-vermelho dos ligantes intrínsecos. Os resultados destas análises mostraram que as moléculas poderiam apresentar diferenças em seus grupos constituintes. Entretanto, os experimentos complementares de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1D 1H e 2D TOCSY) revelaram que as diferenças observadas nas amostras dos ligantes, provenientes de Thi1 e de Thi1(A140V), tratavam-se na verdade de diferenças nas proporções de quatro populações distintas de compostos, compondo um pool de ligantes. Na amostra proveniente de Thi1(A140V), a população dominante correspondeu à molécula de adenosina difosfato, ADP. Ainda, embora em ambas as amostras o ADT tenha sido encontrado, aquela derivada de Thi1(A140V) apresentou uma população significativamente menor deste composto. Concluindo, os resultados demonstraram que a mutação A140V levou a uma maior instabilidade conformacional em Thi1 e, além disso, a presença de quantidades reduzidas de ADT em Thi1(A140V) sugerem que esta alteração tenha contribuído de alguma forma para a redução de sua atividade.Item Desnaturação e reenovelamento da frutalina, uma lectina ligante de D galactose(2008-09-05) Campana, Patricia TargonOs estudos sobre o mecanismo de enovelamento das proteínas é o resultado de um estudo intenso utilizando métodos bioquímicos, biofísicos e teóricos. \"In vitro\", o estado inicial deste estudo é a proteína desnaturada. Neste trabalho, temos estudado o reenovelamento, após desnaturação térmica, de uma glicoproteína denominada frutalina; da família das lectinas. A característica principal desta classe de proteínas é sua habilidade para interagir com carboidratos e, portanto, combinar-se com glicocomponentes da superfície da célula, induzindo suas propriedades biológicas. A frutalina é uma lectina tetramérica extraída das sementes de Artocarpus incisa. Ela é ligante de D-galactose e o espectro de CD (dicroísmo circular) de sua estrutura nativa foi identificado como sendo dominado por folhas ?. A desnaturação térmica e as etapas do reenovelamento foram monitoradas por espectroscopia de CD, fluorescência e também pela perda da atividade hemaglutinante. As condições de desnaturação utilizadas foram aquecimento à 60°C por 30 a 60 minutos, dependendo do tempo de estocagem (a -18°C) da proteína na forma nativa. Os resultados indicaram que o reenovelamento é promovido por um processo de congelamento na presença de PBS contendo 0,l M de D-galactose seguida por centrífugoconcentração em Centriprep 3. A hemaglutinação positiva ocorreu tanto para a fração nativa quanto para a fração reenovelada. O reenovelamento da frutalina desnaturada também ocorreu com PBS contendo 0,1 M de solução de D-glicose. Quando a forma desnaturada foi concentrada antes do congelamento em PBS sem D-galactose ou em PBS contendo xilose, o reenovelamento não ocorreu. Estes resultados mostraram que o reenovelamento da frutalina foi dependente da ligação com a D-galactose ou D-glicose, bem como a importância do congelamento para obter a forma biologicamente ativa. A análise da estrutura secundária utilizando o programa CCA forneceu um resultado importante: para a forma nativa da frutalina obtivemos 85% de folhas ? paralelas e antiparalelas, incluindo voltas ?, enquanto que para a forma reenovelada obtivemos 73%, mostrando que a estrutura reenovelada, a nível secundário, se aproximou satisfatoriamente da nativa, concordando com os resultados obtidos nos testes de hemaglutinação.Item Interferência de peptídeos contendo histidinas na estrutura de proteínas recombinantes: um estudo aplicado à adenina fosforibosil transferase (APRT) de Leishmania tarentolae.(2008-09-10) Caruso, Cecilia SulzbacherEnquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e α-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 ± 0,20 e 7,7 ± 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice α . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-α do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro.Item Desnaturação e renovelamento de lectinas oligoméricas ligantes de D-galactose: estudos no equilíbrio termodinâmico(2008-06-11) Campana, Patricia TargonO estudo de enovelamento de proteínas tem sido um problema de fundamental importância em biofísica e biologia molecular. Neste trabalho, estudamos os processos de desnaturação e renovelamento das lectinas jacalina e frutalina. Estas lectinas são tetraméricas, apresentam alta homologia estrutural, porém diferem em atividade biológica, sendo a frutalina mais potente. Apesar desta homologia, estas lectinas diferem também nos processos de desnaturação e renovelamento como função da temperatura e o comportamento frente ao desnaturante químico hidrocloreto de guanidina (GndHCl). Ambas proteídas foram desnaturadas pela ação de GndHCl e suas curvas de desnaturação medidas por espectroscopia de fluorescência e CD. As medidas de fluorescência da frutalina deram valores de estabilidade conformacional de 17,12 kJ/mol e 12,34 kJ/mol, na presença e na ausência de D-Galactose, enquanto a jacalina forneceu valores de 8,12 kJ/mol para a transição NI e 5,61 kJ/mol para a transição IU em PBS. Os valores na presença de açúcar foram similares. NOs estudos da frutalina foram separadas as formas nativa, desnaturada, renovelada e uma forma molecularmente distinta chamada mal-enovelada, por cromatografia de exclusão molecular. Estas formas foram analisadas por atividades hemaglutinante e espectroscopias de CD e fluorescência. Todos os resultados obtidos confirmaram a ocorrência do renovelamento de ambas lectinas e que os monômeros renovelados, depois de alcançarem sua estrutura tridimensional, se associam espontaneamente para a formação dos tetrâmeros.