Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
URI permanente para esta coleçãohttp://143.107.180.6:4000/handle/RIIFSC/9
Navegar
3 resultados
Resultados da Pesquisa
Item Interações moleculares no mecanismo de ação da galectina-4 humana(2016-06-15) Kumagai, Patricia SuemyA galectina-4 humana (HGal-4), pertencente à família das galectinas, possui dois domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) com alta afinidade para β-galactosídeos e se encontra amplamente distribuída em células normais e neoplásicas de diferentes organismos. Suas funções snglobam uma grande variedade de eventos celulares, tais como processos inflamatórios, neoplásicos, progressão tumoral e metástase. Entretanto, muitas perguntas sobre suas interações com diferentes carboidratos, a especificidade destas interações e o papel específico das galectinas permanecem ainda sem resposta. No presente trabalho, propomos a investigação das interações galectina-glicano da galectina-4 humana e de seus domínios CRDs independentes (CRD-I e CRD-II) através de um conjunto de métodos biofísicos. Através do método de dicroísmo circular (CD), usando várias regiões espectrais, e fluorescência fomos capazes de entender mudanças ocorrentes na estrutura secundária e terciária das protéinas quando da interação com lactose/sacarose. Estes dados, juntamente com testes de hemaglutinação, mostraram que a glectina-4 e os CRDs respondem de forma distinta à ligação com açúcar. Por diferentes técnicas (fluorescência, ITC e MST) determinamos as constantes de dissociação para os domínios CRDs (Kd ~0,5 mM) e para HGal-4 e, de forma qualitativa, os valores obtidos indicaram possíveis estados oligoméricos dessas proteínas. A investigação da interação proteína-membrana da HGal-4 foi feita, primeiramente, com miméticos de membranas e monitorada pela técnica de RPE em crescente complexidade de composição de tais miméticos, indo desde composições mais simples, passando por lipid rafts na presença de diferentes glicolipídeos (GM1, LPS) e chegando-se à interação com células tumorais (U87MG, T98G e HT-29). Tais experimentos mostraram que galectina-4 reconhece e se liga naqueles modelos onde existem glicanos complexos na superfície. Investigamos também a participação de HGal-4 endógena e exógena no tratamento quimioterápico de células tumorais e verificamos um papel importante de HGal-4 para células HT-29. Finalizando esta tese, apresentamos o trabalho realizado em um ano de estágio na University of Oxford, durante o qual, investigamos a estrutura da região C-terminal de um receptor da família GPCR, qual seja o receptor de neurotensina NTS1. Aqui, mais uma vez, foi empregada a técnica de RPE que aliada à produção/marcação de mutantes do receptor, permitiu determinar que a hélice H8 se estabiliza quando em proteolipossomos.Item Estudos da correlação estrutura-função da enzima Clorocatecol 1,2-Dioxigenase de Pseudomonas putida(2012-05-03) Mesquita, Nathalya Cristina de Moraes RosoO intenso uso de compostos orgânicos em conjunto com o grande avanço industrial culminou em um enorme acúmulo de poluentes orgânicos no meio ambiente. Dentre estes poluentes têm-se destacado a presença de hidrocarbonetos aromáticos altamente tóxicos e resistentes à degradação física, química, fotolítica e biológica. Desta maneira, uma nova forma de combater a presença deste tipo de composto no meio ambiente têm sido estudada: o uso de microorganismos, naturais ou geneticamente modificados, capazes de transformá-los em substâncias inertes, como CO2 e água. Tal metodologia é denominada biorremediação. Dentres estes microorganismos destacam-se bactérias dos gêneros Pseudomonas, Aeromonas, Beijerinckia, dentre outros, que têm sido estudadas para esta finalidade. A enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD) é uma das proteínas expressas por bactérias do gênero Pseudomonas putida, sendo responsável pela clivagem de hidrocarbonetos aromáticos através da incorporação de ambos os átomos de uma molécula de oxigênio à estrutura do anel aromático, sendo a proteína escolhida para desenvolvermos o presente trabalho. Mais especificamente, nos interessa estudar como o mecanismo de ação da referida enzima é controlado por moléculas extrínsecas, como fosfolipídios. Tal interesse pela interação entre a enzima e fosfolipídios surgiu recentemente quando da obtenção da primeira estrutura cristalográfica de uma enzima da família da CCD (dioxigenases intradióis). Nesta estrutura foi observado um sítio de ligação por monômero para fosfolipídios, o que fez com que várias questões relativas à influência desses sobre a atividade da enzima fossem levantadas. Nosso objetivo foi fazer uso das técnicas de Dicroísmo Circular (CD), Calorimetria e Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) para estudar alterações conformacionais da enzima e de sua cinética induzidas por moléculas de fosfolipídio, e assim, obter informações que correlacionem as mudanças estruturais com o mecanismo de atividade enzimática da enzima. Os resultados obtidos através do uso daquelas técnicas em conjunto com protocolos que possibilitam a delipidação da enzima mostraram que a presença do fosfolipídios na estrutura da enzima tem influência sobre a atividade enzimática. Quando retiramos o fosfolipídio/ácido graxo, pudemos visualizar uma pequena mudança na estrutura secundária da enzima, um aumento da entalpia de reação, bem como um aumento na velocidade de reação, enquanto que a afinidade da enzima pelo substrato diminuiu. Pudemos também observar uma maior estabilidade térmica da enzima quando na ausência do fosfolipídio/ácido graxo e não foi observado interação da Pp 1,2-CCD com modelos micelares constituídos por lisofosfolipídios. Um breve estudo realizado sobre o papel da força iônica na atividade e na estabilidade térmica da proteína mostrou que na ausência de NaCl, em pH 8, a enzima se mostrou mais ativa, com uma afinidade pelo substrato maior e neste ambiente com baixa força iônica foi observado uma pequena interação da enzima com modelos micelares carregados negativamente. Assim, pudemos concluir que as moléculas anfipáticas, retiradas com os processos de delipidação, apesar de modificarem muito pouco a estrutura secundária da enzima, ainda assim instauram modificações na sua função de catálise do substrato catecol. Esta informação juntamente com os dados sobre inibição do processo reacional ocasionada pelo produto da reação formam um novo conjunto de dados que pode ser utilizado para se alcançar o objetivo mais geral de se controlar a atividade biológica da Pp 1,2-CCD.Item Interações moleculares no mecanismo de ação de clorocatecol 1,2-dioxigenase e da tirosina quinase FGFR2(2010-05-04) Melo, Fernando Alves deNeste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar as interações moleculares no mecanismo de ação de clorocatecol 1,2-dioxigenase e da tirosina quinase FGFR2. Na primeira parte desta tese, descrevemos uma série de experimentos envolvendo a interação da enzima clorocatecol 1,2- dioxigenase (1,2-CCD) com seus ligantes naturais e também com miméticos de membranas biológicas (micelas de surfactantes, monacamadas lipídicas e lipossomos). Utilizamos a técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) para mostrar que tanto o substrato, quanto o produto da reação inibem a cinética enzimática mediada por 1,2-CCD. Resultados obtidos com as técnicas de calorimetria de varredura diferencial (DSC) e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) confirmaram que a inibição se dá devido à ligação direta do produto da reação no sítio catalítico da enzima. Sendo assim, nossos dados indicam que o produto da reação exerce um papel relevante na catálise mediada por 1,2-CCD, devendo ser levado em consideração para estudos futuros que versem sobre a regulação da atividade desta enzima. Em outra vertente, investigamos a capacidade de 1,2-CCD de se ligar a modelos de membranas. Para isso, utilizamos as técnicas de RPE, DSC e de monocamadas de Langmuir no monitoramento das alterações nos miméticos de membranas (micelas dos surfactantes SDS e CTABr, monocamdas de DPPC e lipossomos de DPPC e DMPC) quando da adição de 1,2-CCD. Este conjunto de dados aponta claramente para a existência da referida interação, o que pode representar, junto com a inibição por produto, outro mecanismo de regulação do metabolismo desta enzima dentro da célula. Na segunda parte de nosso estudo, utilizamos a técnica de ITC para acessar as cinéticas de autofosforilação de FGFR2 quinase e de fosforilação, catalisada por FGFR2 quinase, da isoforma p52 da proteína Shc. A fosforilação reversível da cadeia lateral de aminoácidos é um princípio de regulação da atividade de enzimas e sinalização de proteínas largamente utilizado pelas células. Para tornarem-se ativas, proteínas tirosina quinase (PTK) autofosforilam-se hidrolisando moléculas de ATP em ADP em uma reação sequencial e precisamente ordenada. Uma vez ativas, interagem com proteínas adaptadoras, como Shc, que são fosforiladas pelo intermédio de PTK. Assim que é fosforilada, Shc torna-se apta a interagir com outras proteínas importantes no processo de sinalização celular para formar os complexos de sinalização primários (ESC). Nossos resultados mostram que o processo de autofosforilação da FGFR2 é governado por uma cinética cooperativa e com a ordem de fosforilação dos resíduos de tirosina provavelmente idêntica àquela previamente determinada para FGFR1. Já para a fosforilação de Shc, a cinética tende a mudar com a temperatura, sendo que a 10oC ocorre segundo um mecanismo de Michaelis- Menten, enquanto que a 15oC podemos identificar uma indefinição de comportamento deste sistema, uma vez que os dados podem ser ajustados pelos modelos de Michaelis-Menten e Hill. Já para 20oC, vemos uma mudança no perfil catalítico, mostrando um certo grau de cooperatividade. Estes resultados, além de estabelecerem características da cinética de fosforilação de FGFR2 e Shc ainda não reportadas, também validam o método calorimétrico utilizado para determinar os parâmetros cinéticos associados àquele processo.