Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
URI permanente para esta coleçãohttp://143.107.180.6:4000/handle/RIIFSC/9
Navegar
2 resultados
Resultados da Pesquisa
Item Mobilidade da hélice 12 de receptores nucleares: comparação entre simulações de dinâmica molecular e experimentos de anisotropia de fluorescência(2013-04-22) Batista, Mariana Raquel BunoroReceptores nucleares formam uma superfamília de proteínas responsáveis pela regulação da expressão de genes. Estruturalmente, são formados por três domínios: um domínio N-terminal bastante variável, um domínio altamente conservado de ligação com o DNA e um domínio C-terminal, menos conservado, denominado domínio de ligação com o ligante (LDB). Diversos experimentos mostram que a interação com o ligante afeta a estrutura e a mobilidade da hélice C-terminal dos receptores nucleares (hélice 12 do domínio de ligação com o ligante), sendo o principal mecanismo de ativação e repressão da transcrição. As primeiras estruturas de LBDs de receptores nucleares revelaram importantes diferenças entre estruturas contendo ligantes (holo) e estruturas apo, principalmente no que diz respeito a posição da hélice 12: em estruturas apo, foi observada a H12 em uma conformação aberta, expondo o sítio de ligação com o ligante, enquanto que em estruturas holo, foi observada a H12 em uma conformação fechada, dobrada sobre o corpo do LBD e envolvendo completamente o ligante. Essa diferença sugeriu um mecanismo para a entrada e saída de ligantes do sítio de ligação denominado modelo da ratoeira, entretanto, esse modelo apresenta diversas inconsistências e tem sido desacreditado. Estudos experimentais e teóricos recentes mostram que a hélice 12 é mais móvel na ausência de ligantes, entretanto, esses estudos não fornecem evidencias de que o aumento da mobilidade da está associado com o deslocamento da H12 em relação ao corpo do LBD, como sugerido pelo modelo da ratoeira. Embora esteja claro que a hélice 12 é mais móvel na ausência de ligantes, a dimensão da variação conformacional sofrida pela hélice 12 ainda não está clara. Nesse trabalho buscamos a construção de um modelo capaz de dimensionar a mobilidade da hélice 12 através da comparação direta entre simulações de dinâmica molecular e experimentos de anisotropia de fluorescência resolvida no tempo. Utilizando simulações de dinâmica molecular reproduzimos experimentos de anisotropia de fluorescência acoplando a sonda cys-flúor a hélice 12 do PPARγ para estudar sua mobilidade. Mostramos que as observações experimentais só podem ser explicadas por conformações onde a sonda fluorescente permanece presa a superfície do LBD. Foi mostrado também que curvas de anisotropia com decaimentos comparáveis com os decaimentos experimentais estão associados a pequenas variações conformacionais de hélice 12. Simulações para dois modelos de apo-PPARγ com a H12 aberta em relação ao corpo do LBD e para as estruturas cristalográficas de apo-RXR e apo-ER, onde a H12 também adota uma conformação aberta, revelaram curvas de anisotropia com decaimentos mais rápidos que os experimentais. Esses resultados implicam em um modelo onde a H12 sofre alterações conformacionais locais, não apresentando variações tão dramáticas como o proposto pelo modelo da ratoeira.Item Estudos por modelagem e dinâmica molecular integradas a técnicas físicas para biomoléculas em solução - interação de receptores nucleares a elementos responsivos no DNA e dinâmica inter-domínios da celobiohidrolase I(2011-12-07) Lima, Leonardo Henrique França deMovimentos coletivos prestam um papel fundamental na dinâmica e energética de biomoléculas em solução. Estes movimentos permitem o acoplamento de regiões significativamente distantes, apresentando considerável influência, por exemplo, no alosterismo para a formação de complexos macromoleculares e no funcionamento integrado de proteínas multidomínios como \"máquinas moleculares\". Neste trabalho de doutoramento, serão apresentados os resultados referentes à aplicação conjunta de técnicas experimentais biofísicas, de modelagem estrutural e de dinâmica molecular no estudo de dois sistemas para os quais estes movimentos coletivos demonstram considerável importância funcional. Para a interação do receptor nuclear do ácido 9-cis-retinóico com seu elemento responsivo específico no DNA (HRE), a comparação de estudos de dinâmica molecular com ensaios de afinidade por anisotropia de fluorescência sugere que a resistência inicial para a associação do monômero, seguida da acentuada colaboratividade na associação do dímero é regida por um impedimento da associação do domínio de ligação ao DNA (DBD) para o primeiro à sequência responsiva devido, em última análise, a uma não complementaridade dos modos coletivos mútuos. Este impedimento para a associação monomérica inicial é mais acentuado para o monômero 5\' (para o qual a menor especificidade de ligação à seqüência específica já é bem documentada), devido aos efeitos conjuntos de um \"defeito\" natural no empacotamento de bases da seqüência responsiva, que se manifesta mais significativamente na interface entre o meio-sítio 5\' e a seqüência espaçadora, e dos modos vibracionais entre os dois sítios decorrentes de seu faseamento relativo na topologia do DNA na seqüência responsiva, caracterizando um mecanismo \"chave e fechadura\" para a interação obrigatoriamente simultânea dos dois monômeros ao DNA. No segundo caso, um estudo integrado utilizando a técnica experimental de espalhamento de raios X a baixos ângulos e uma abordagem de modelagem estrutural baseada em dinâmica molecular foi realizado para a celobiohidrolase I de Trichoderma harziannum. Este estudo permitiu tanto a elaboração de um modelo estrutural de maior resolução para esta enzima de alto potencial biotecnológico como a constatação dos possíveis mecanismos moleculares a partir dos quais as glicosilações no peptídeo conector impõem restrições à orientação e modos vibracionais entre seus dois domínios de forma condizente com sua ação concertada na interação e no deslize da enzima sobre a superfície celulósica, ambos de fundamental importância para a processividade da enzima na hidrólise do substrato microcristalino.