Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Adenina fosforibosiltransferase de Schistosoma mansoni: proposta de detalhamento do mecanismo catalítico por dinâmica molecular(2011-10-21) Caldas, Victor Emanoel ArminiA Adenina Fosforibosiltransferase (APRT E.C. 2.4.2.7) pertence à família de enzimas Fosforibosil Transferases (PRTase) do Tipo I , que catalisa a conversão reversível de Adenina e 5-fosfo-α-D-ribose-1-difosfato (PRPP) em difosfato e adenosina monofosfato, um importante precursor energético da célula. A APRT integra a via de salvação de purinas, única forma de suprir o balanço de purinas em Schistosoma mansoni. Este trabalho apresenta o isolamento, clonagem, expressão heteróloga e purificação da APRT de S. mansoni a fim de caracterizá-la quanto seus parâmetros físico-químicos. Não se obtendo cristais de proteína, foram elaborados modelos tridimensionais por homologia para estudos de dinâmica molecular e avaliação conformacional via tCONCOORD. A estrutura de APRT humana foi usada como controle nas simulações. Os dados computacionais e de biologia molecular foram comparados entre si para validação mútua e, verificou-se que a análise cuidadosa de dados computacionais é capaz de fornecer informações críticas sobre a APRT, auxiliando e guiando os estudos experimentais. Ainda, as simulações de dinâmica molecular foram capazes de evidenciar a abertura de loops do sítio ativo, explicitar a importância da análise de rotâmeros em modelos, permitindo, então, rearranjar da forma correta resíduos erroneamente modelados. Por fim, um estudo envolvendo mecanismo catalítico sugere a participação de uma molécula de água abstraindo o próton ligado ao N9 da adenina e, para efeito de comparação, um mecanismo alternativo independente desta participação também foi descrito. Ambas as observações expandem a corrente visão sobre o mecanismo catalítico de APRTs.Item Estudos estruturais e correlação com a síndrome urolitíase de mutantes da adenina fosforribosiltransferase humana(2011-08-29) Pimenta Junior, Alécio AntonioA 2,8-DHA Urolitíase é uma doença resultante de uma desordem hereditária que leva a deficiência de atividade da enzima APRT do grupo das PRTases. Até o momento, foram encontradas 18 mutações em pacientes, das quais 7 são missense. O presente trabalho dedica-se ao estudo funcional e estrutural dessas 7 mutações e da deleção ΔF173. Construções dos mutantes D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F e F173G foram obtidas no vetor pET-29a(+) e clonados em E. coli. Os protocolos de expressão e purificação foram estabelecidos, onde as enzimas foram obtidas após uma etapa cromatográfica na coluna CHTTM Hidroxiapatita Cerâmica no grau de pureza necessário. A única exceção foi o mutante I112F que se mostrou insolúvel durante a expressão. Um ensaio cinético acoplado através de kit para detecção de PPi foi padronizado e permitiu a caracterização cinética da hAPRT nativa e de seu mutantes. Os mutantes apresentaram perdas de eficiência de uma ordem de magnitude, com exceção do F173G, cujos valores foram comparáveis aos da hAPRT nativa. Ensaios de cristalização foram realizados para todos os mutantes e resultaram em cristais para os mutantes F173G, R67Q e R89Q. Esses cristais foram coletados na linha de Cristalografia de Macromoléculas 2 no LNLS. Os conjuntos de dados estão sendo analisados e as estruturas estão em fase final de refinamento.Item Interferência de peptídeos contendo histidinas na estrutura de proteínas recombinantes: um estudo aplicado à adenina fosforibosil transferase (APRT) de Leishmania tarentolae.(2008-09-10) Caruso, Cecilia SulzbacherEnquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e α-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 ± 0,20 e 7,7 ± 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice α . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-α do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro.Item Aspectos de biologia molecular, estrutural e funcional de adenina fosforribosiltransferase de Homo Sapiens e seu envolvimento na sindrome urolitíase(2008-06-16) Silva, MárcioEsta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita.