Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Estudos moleculares das enzimas Fosfoseril-tRNA sintease de Trypanosoma brucei e Leishmania major e Seril-tRNA sintease de Trypanosoma brucei(2009-08-07) Evangelista, Jaqueline PesciuttiO estudo do processo de tradução no metabolismo celular atrai o interesse de vários grupos, em particular, o estudo do 21o aminoácido, a selenocisteína. A incorporação da selecisteína foi descrita em Escherichia coli e recentemente em eucariotos. O primeiro passo desta via é iniciado pela Seril-tRNA Sintetase que aminoacila o Ser-tRNASec (SelC) com uma serina. Em E. coli, o segundo passo é realizado pela Sec-sintetase (SelA) que remove o grupo hidroxil da cadeia lateral da serina, formando um intermediário aminoacrilil. Este serve como aceptor de seleno-fosfato gerando a selenocisteína. Em eucariotos, o processo análogo é realizado pela PSTK e pela SepSecS, que fosforila e seleniza a serina respectivamente. Interessados nesta parte da via, iniciamos estudos moleculares das enzimas Fosfoseril-tRNA Kinase de Trypanosoma brucei e Leishmania major e Seril-tRNA Sintetase de Trypanosoma brucei. Para o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de T. brucei não foi possível obter um clone sem mutação. Já o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de L. major foi clonado em vetor pET28 e a enzima foi expressa em células de E. coli porém com baixo rendimento impedindo a continuidade dos experimentos planejados. Portanto passou-se a investigar a enzima envolvida no primeiro passo da via, no caso, a Seril-tRNA Sintetase de T. brucei. Esta já se encontrava clonada e expressando em E. coli na fração solúvel. A proteína recombinante foi purificada com precipitação com 60% de sulfato de amônio e resinas de hidrofobicidade e de afinidade por níquel. Experimentos de gel nativo, DLS e fluorescência de anisotropia revelaram que, após a purificação, a enzima permanece estável e livre de agregações, possuindo um raio hidrodinâmico de 4,32nm e massa molecular de 110kDa. Acima de 150nM de proteína, ela encontra-se inteiramente na forma dimérica. Estabelecidos estes parâmetros, informações sobre a ligação com o Ser-tRNASec poderão ser obtidos a partir da técnica de anisotropia de fluorescência visto que experimentos iniciais realizados com a SerRS adicionando-se o Ser-tRNASec mostraram-se promissores.Item Estudos moleculares das enzimas envolvidas na biossíntese de selenocisteína em Trypanosoma brucei e Leishmania major(2008-09-09) Rodrigues, Elisandra MárciaUmas das principais formas biológicas de incorporação do selênio é na forma de um aminoácido denominado selenocisteína (Sec, U), que é incorporado co-traducionalmente ao polipeptídio nascente em posições específicas do códon UGA, que normalmente é reconhecido como códon de parada. A incorporação de selenocisteína em E. coli já está completamente esclarecida, com a participação dos genes que codifica para selenocisteína sintase (SELA), seril-tRNA sintetase (SerRS), um tRNASec específico (SELC), selenofosfato sintetase (SELD) e um fator de elongação próprio (SELB). Entretanto em eucariotos não há homólogos para SELA e existem evidências de haver a necessidade de dois passos enzimáticos que substituem a atividade desempenhada por SELA, com uma fosforilação da serina seguida de uma selenilação através das enzimas Fosfo-Seril-tRNASec Kinase (PSTK) e Sep-tRNA:Sec-tRNA sintase (SepSecS), respectivamente. A via de biossíntese e incorporação de selenocisteína é muito estudada em alguns organismos, mas ainda pouco explorada em Kinetoplastida. Nesse sentido, realizaram-se estudos moleculares das enzimas envolvidas nessa via, mais especificamente em Trypanosoma brucei e Leishmania major. Foram identificados o elemento SECIS na região 3´ do mRNA que atua no reconhecimento do códon UGA interno e, em fase de leitura na inserção de selenocisteína em Leishmania major e Leishmania infantum; a incorporação de Se75 em proteínas de Leishmania; a ocorrência do tRNASec em Trypanosoma e Leishmania e, adicionalmente todos os genes necessários para a síntese de selenocisteína: SELB, SELD, PSTK e SECp43. Foram obtidos clones dos genes selB e selD em vetor de expressão pET28a(+) e as proteínas foram expressas em bactérias Escherichia coli cepa BL21 (DE3). A proteína recombinante SELD foi purificada em cromatografia de afinidade e seu pI e massa molecular foram determinados usando as técnicas de sistema Phast de eletroforese e gel nativo. As proteínas SELB, SELD, SECp43 e Seril tRNA sintetase foram imunolocalizadas no citoplasma de células nativas de T. brucei. Uma nova metodologia \"PTP tagging\" foi utilizada para estudos de interação protéica com uso de proteínas alvos SECp43, SELB e PSTK na busca de novas proteínas ligantes na via de selenocisteínas em T. brucei. Futuras investigações moleculares e estruturais das enzimas envolvidas na via de selenocisteína em Kinetoplastida poderão trazer informações relevantes no entendimento da biossíntese desse aminoácido, assim como possibilitar o desenvolvimento de inibidores específicos visando o tratamento de doenças causadas pelos parasitas Trypanosoma brucei e Leishmania major.