Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Bases moleculares e estruturais do reconhecimento de ligantes pela proteína transtirretina humana(2010-10-20) Trivella, Daniela Barretto BarbosaMais de quarenta proteínas humanas estão envolvidas em doenças amilóides, sendo a transtirretina (TTR) uma dessas. A dissociação do tetrâmero da TTR é a etapa limitante para sua via de agregação. Esta etapa pode ser dificultada pela ligação de pequenas moléculas a dois sítios na interface tetramérica da TTR e facilitada em variantes mutantes. A mutante V30M é a variante amiloidogênica mais frequente da TTR e, apesar da mutação não se encontrar no sítio de ligação de pequenas moléculas, pode limitar a interação de inibidores com esta proteína. Desta forma, a busca de inibidores da agregação da TTR tipo selvagem (TTRwt) e mutantes amiloidogênicas vem sendo realizada. Na presente tese, flavonóides, freqüentemente encontrados em alimentos, e agonistas sintéticos do receptor do hormônio tireoidiano, seletivos para a isoforma beta deste receptor, foram selecionados para testes de inibição da agregação da TTRwt e mutante V30M. A interação dos melhores inibidores com a TTR foi também caracterizada em detalhes. Para isto, um ensaio de agregação in vitro da TTR foi utilizado para triagem dos compostos; e a assinatura termodinâmica da interação dos melhores inibidores com a TTR, bem como as estruturas cristalográficas TTR:inibidores foram determinadas por calorimetria de titulação isotérmica e cristalografia de proteínas, respectivamente. Os compostos sintéticos, GC-1 e GC-24, mostraram-se inibidores eficazes, porém com potência moderada. Já as flavonas luteolina (LUT), apigenina (API) e crisina (CHR), a flavanona naringenina (NAR), o flavonol kaenferol (KAE) e a isoflavona genisteína (GEN) apresentaram boa potência e eficácia de inibição da agregação da TTR in vitro. Os inibidores NAR, CHR, GEN e KAE não mostraram mesma capacidade de inibição da mutante V30M e apresentaram cooperatividade negativa para ligação aos dois sítios da TTR. A posição dos inibidores no sítio, bem como a variabilidade química/ estrutural dos compostos testados parecem influenciar os mecanismos de interação com os dois sítios da TTR e a ligação à mutante V30M. Modificações no sítio da mutante V30M foram identificadas e são apontadas como a principal causa para a seletividade de alguns inibidores à forma selvagem da TTR. De modo geral, a investigação detalhada da interação de pequenas moléculas com a TTR permitiu propor as bases moleculares da cooperatividade entre os sítios desta proteína e das diferenças de interação dos inibidores com a forma selvagem e mutante V30M da TTR.Item Planejamento de inibidores da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi: biologia estrutural e química medicinal(2008-06-10) Guido, Rafael Victório CarvalhoA Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, atinge cerca de um quarto da população da América Latina. Os fármacos disponíveis para o tratamento desta doença são inapropriados, apresentam baixa eficácia e sérios efeitos colaterais que limitam o seu uso. Esse grave panorama torna urgente a descoberta de novos agentes quimioterápicos para o tratamento seguro e eficaz da doença. A via glicolítica é principal forma de obtenção de energia de tripanosomatídeos. Um alvo molecular atrativo desta via bioquímica que desempenha papel essencial no controle do fluxo glicolítico do Trypanosoma cruzi, a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), foi selecionada neste trabalho de Tese para estudos em biologia estrutural e química medicinal visando à identificação e planejamento de novos inibidores enzimáticos. Neste contexto, triagens biológicas resultaram na identificação de compostos de origem natural e sintética com atividade inibitória in vitro frente à GAPDH de T. cruzi, ampliando a diversidade química de moduladores seletivos deste alvo. Estudos cinéticos e estruturais demonstraram o comportamento não cooperativo entre os sítios ativos da enzima GAPDH de T. cruzi em relação à interação com o cofator NAD+, fornecendo importantes evidências mecanísticas e estruturais para uma melhor compreensão das bases moleculares envolvidas no processo de reconhecimento molecular. Os estudos das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR 2D e QSAR 3D) resultaram na geração de modelos com elevada consistência estatística interna e externa, além de alto poder preditivo da propriedade-alvo. Além disso, estudos de modelagem molecular e de QSAR 3D revelaram aspectos estruturais relevantes para o planejamento de inibidores seletivos da enzima GAPDH de tripanosomatídeos. Por fim, uma estratégia de triagem virtual baseado na estrutura do receptor foi empregada para a identificação de novos inibidores da GAPDH de T. cruzi, consistindo, entre outros, na aplicação de filtros hierárquicos sucessivos envolvendo restrições farmacofóricas e estudos de docagem molecular que resultaram na seleção de 35 candidatos a inibidores da enzima-alvo. Os trabalhos integrando estudos em química medicinal e biologia estrutural apresentados nessa Tese de Doutorado significam importantes contribuições no desenvolvimento de bases científicas sólidas para o planejamento de novos inibidores potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi, um alvo molecular de alta prioridade em nosso grupo de pesquisa.