Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Clonagem molecular, expressão, purificação e caracterização estrutural da endoglucanase de Trichoderma harzianum visando o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos para a produção de etanol lignocelulósico(2016-05-12) Pellegrini, Vanessa de Oliveira ArnoldiO aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas.Item Estudos funcionais e estruturais de uma endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium da família 45 das hidrolases de glicosídeos(2016-03-14) Ramia, Marina PaglioneA importância do estudo das celulases não se limita à aquisição de conhecimento científico, mas também ao grande potencial biotecnológico que elas representam. Isso se deve ao fato da celulose ser a molécula mais abundante presente na natureza e prover uma vasta gama de produtos e processos sustentáveis. Muitas famílias de celulases já foram bem caracterizadas, enquanto outras permanecem ainda desconhecidas. Dentre estas últimas, a família 45 das hidrolases de glicosídeos é a família de celulases fúngicas menos caracterizada tanto estruturalmente quanto funcionalmente. Recentemente foi proposta a divisão dessa família em três subfamílias e, até agora, apenas membros da subfamília A tiveram enzimas estruturalmente elucidadas. Nesse trabalho reportamos a estrutura cristalográfica da proteína recombinante endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), a primeira das hidrolases de glicosídeos da subfamília C, e seu complexo com celobiose a 1,4 Å e 1,7 Å de resolução, respectivamente. A PcCel45A é uma enzima de domínio único, com uma estrutura em β-barril e seu empacotamento geral remete ao formato de âncora. O sítio ativo da enzima forma um longo sulco na superfície da estrutura, sendo que o seu centro catalítico é diferente das outras enzimas publicadas dessa família e o aspartato catalítico, que atua como aceptor de próton na reação de inversão, (Asp10) não é conservado. Adicionalmente, a estrutura cristalográfica dessa enzima apresenta mais similaridades com as β-expansinas (proteínas de plantas) e transglicosilases líticas (proteínas que clivam o peptidoglicano de bactérias) do que com as outras representantes da família 45, o que a torna ainda mais singular. Para entendermos melhor seu funcionamento foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos principais resíduos do sítio ativo. O Asp121, conhecido por participar da reação de inversão das outras enzimas da família como doador de próton, mostrou-se essencial para a atividade da enzima, enquanto que outros resíduos conservados como a Tyr25, o Trp161 e o Asp92 afetaram, mas não aniquilaram a atividade da enzima, apresentando aproximadamente 20%, 50% e 10% da atividade da enzima nativa, respectivamente.Item Caracterização bioquímica e biofísica da Celobiohidrolase II do fungo Trichoderma harzianum IOC3844 produzida por expressão homóloga(2012-10-25) Voltatodio, Maria LuizaO esgotamento das reservas, especialmente do petróleo mais fino, aliado à crescente demanda energética e à necessidade inadiável de reduzir as emissões de carbono para a atmosfera, sinalizam para a necessidade da busca de novas fontes de energia renováveis e limpas. As preocupações com o aquecimento global têm feito crescer o interesse mundial pelos biocombustíveis. O novo conceito de biocombustíveis de segunda geração corresponde à produção de etanol combustível a partir de biomassa lignocelulósica como matéria-prima. No entanto, para tornar possível a utilização da biomassa é necessária a conversão das moléculas constituintes da parede celular em açúcares fermentáveis. A tecnologia mais promissora para a conversão dessa biomassa lignocelulósica à etanol combustível é com base na hidrólise enzimática da celulose usando celulases. Alguns microrganismos como o fungo Trichoderma SSP. secretam um eficiente complexo enzimático de celulases. Tendo as celobiohidrolases, elevada importância na hidrólise primária da celulose, o objetivo desse trabalho foi realizar a caracterização bioquímica e biofísica a celobiohidrolase II (CBHII) do complexo de celulases do fungo filamentoso Trichoderma harzianum IOC 3844. A enzima depois de purificada mostrou uma melhor atividade contra o substrato pNPC a 60°C em pH 4,8. Estudos de eletroforese capilar mostraram apenas moléculas com uma unidade de glicose para um substrato simples inicial contendo 5 glicoses. Análises de dicroísmo circular mostraram um padrão de estrutura secundária predominante em alfa hélice, e na análise da estrutura terciária, o espectro de emissão da CBHII mostrou um comprimento de onda de fluorescência máxima a 333nm em pH5,0, indicando que os triptofanos estão parcialmente expostos ao solvente. Ensaios utilizando a técnica de espalhamento de luz a baixo ângulo, permitiram a geração de um modelo tridimensional o qual mostrou-se domínios globulares unidos por um linker, e as posições relativas entre eles, demonstrando grande similaridade com enzimas CBHII já descritas na literatura, e sendo assim, de grande interesse biotecnológico para hidrólises de biomassas.