Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Desenvolvimento de um sistema de imagem de campo amplo de fluorescência para localização de linfonodo sentinela empregando a indocianina verde(2016-05-09) Govone, Angelo BiasiA fluorescência é uma técnica amplamente empregada na área de diagnóstico médico, com aplicações distintas. Uma de suas aplicações é a detecção de um determinado marcador que pode ser injetado no paciente. A indocianina verde (ICG) é um exemplo de marcador fluorescente que pode ser empregado para auxiliar na identificação do linfonodo sentinela. A excitação é realizada em 780 nm e a emissão detectada ao redor de 850 nm. Tais comprimentos de onda são muito favoráveis para aplicação médica por apresentarem pouca absorção por tecidos biológicos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema de imagens por fluorescência de ICG. Este sistema é basicamente constituído por um dispositivo de iluminação e de aquisição e tratamento de imagem. Dois protótipos foram construídos e testados, um com excitação Laser e o segundo a LED. O dispositivo de iluminação oferece uma iluminação uniforme em uma área de 10 por 15 cm a uma distância de 30 cm. A fluorescência é captada por um sistema composto por duas câmeras perpendiculares uma à outra e um espelho dicroico angulado 45° a ambas, cuja função é separar a imagem por bandas. Uma das câmeras capta a imagem refletida do espelho no espectro visível e a outra capta a imagem transmitida pelo espelho no infravermelho. As imagens obtidas pelas câmeras recebem tratamento em uma rotina desenvolvida em plataforma LabVIEW® para destacar a região com fluorescência sobreposta na imagem sob iluminação branca em tempo real, sendo possível salvar figuras ou vídeos, dependendo da necessidade do operador. O equipamento foi testado no Hospital de Câncer de Barretos em pacientes para ressecção cirúrgica de tumores de cabeça e pescoço e de melanoma e apresentou resultados promissores.Item Planejamento de moduladores de polimerização de microtúbulos com propriedades anticâncer, análise estrutural de macromoléculas e geração de uma base virtual de produtos naturais(2016-03-02) Santos, Ricardo Nascimento dosOs trabalhos realizados e apresentados nesta tese de doutorado compreendem diversos estudos computacionais e experimentais aplicados ao planejamento de candidados a novos fármacos para o tratamento do câncer, de uma metodologia inovadora para investigar a formação de complexos proteicos e de uma base de compostos naturais reunindo parte da biodiversidade brasileira com a finalidade de incentivar e auxiliar a descoberta e o desenvolvimento de novos fármacos no país. No primeiro capítulo, são descritos estudos que permitiram a identificação e o desenvolvimento de novas moléculas com atividade anticâncer, através da integração de ensaios bioquímicos e métodos de modelagem molecular na área de química medicinal. Dessa forma, estudos de modelagem molecular e ensaios bioquímicos utilizando uma base de compostos disponibilizada pela colaboração com o Laboratório de Síntese de Produtos Naturais e Fármacos (LSPNF) da UNICAMP, permitiram identificar uma série de moléculas da classe ciclopenta-β-indóis como inibidores da polimerização de microtúbulos com considerável atividade anti-câncer. Estes compostos apresentaram-se capazes de modular a polimerização de microtúbulos em ensaios in vitro frente ao alvo molecular e a células cancerígenas, com valores de IC50 na faixa de 20 a 30 μM. Além disso, estudos experimentais permitiram identificar o sítio da colchicina na tubulina como a região de interação desta classe e ensaios de migração celular comprovaram sua atividade antitumoral. A partir dos resultados obtidos, estudos mais aprofundados de docagem e dinâmica molecular permitiram elucidar as interações moleculares envolvidas no processo de ligação à proteína tubulina, e a utilização destes modelos moleculares no planejamento, síntese e avaliação de uma nova série de compostos. Com base nos dados obtidos por estudos computacionais, modificações foram propostas e novos inibidores da polimerização de tubulina foram planejados, sintetizados e avaliados, resultando na identificação de um inibidor de elevada atividade e perfil farmacodinâmico superior dentre as moléculas planejadas, com IC50 de 5 μM. Concomitantemente, ensaios de citotoxicidade in vitro demostraram uma interessante seletividade destes compostos por células cancerígenas em comparação a células saudáveis. Os estudos desenvolvidos com inibidores de tubulina aqui apresentados permitiram identificar moduladores da polimerização de microtúbulos com excelente perfil anti-câncer, que servirão como modelo para o desenvolvimento de novos tratamentos eficazes contra o câncer. No segundo capítulo é apresentado um novo método para predizer modificações conformacionais e a formação de complexos multiméricos em sistemas proteicos. Este método foi elaborado durante os estudos desenvolvidos ao longo de um programa de intercâmbio no laboratório The Center for Theoretical and Biological Physics (CTBP, Rice University, Estados Unidos), sob orientação do professor Dr. José Nelson Onuchic. Durante este projeto, estudos de modelagem computacional foram realizados utilizando métodos computacionais modernos desenvolvidos no próprio CTBP, tal como o método de Análise de Acoplamento Direto (DCA, do inglês Direct-Coupling Analysis) e um método de simulação conhecido como Modelagem Baseada em Estrutura (SBM, do inglês Structure-Based Modeling). Nos estudos aqui apresentados, os métodos DCA e SBM desenvolvidos no CTBP foram combinados, modificados e ampliados no desenvolvimento de uma nova metodologia que permite identificar mudanças conformacionais e elucidar mecanismos de enovelamento e oligomerização em proteínas. Os resultados obtidos através da predição de diversos complexos proteicos multiméricos com uma alta precisão mostram que este sistema é extremamente eficaz e confiável para identificar regiões de interface de contato entre proteínas a a estrutura quaternária de complexos macromoleculares. Esta nova metodologia permite a elucidação e caracterização de sistemas proteicos incapazes de serem determinados atualmente por métodos puramente experimentais. No terceiro capítulo desta tese de doutorado, é descrito a construção de uma base virtual de dados em uma iniciativa pioneira que tem como principal objetivo reunir e disponibilizar o máximo possível de toda a informação já obtida através do estudo da biodiversidade brasileira. Esta base, intitulada NuBBE DataBase, reúne diversas informações como estrutura molecular 2D e 3D e informações de atividades biológicas de diversas moléculas já isoladas pelo Núcleo de Bioensaios Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE), localizado na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP). A NuBBEDB será de grande utilidade para a comunidade científica, fornecendo a centros de pesquisa e indústrias farmacêuticas informações para estudos de modelagem molecular, metabolômica, derreplicação e principalmente para o planejamento e a identificação de novos compostos bioativos.Item Síntese supramolecular e caracterização de novas formas sólidas dos fármacos 5-fluorocitosina e 5-fluorouracila(2015-11-24) Silva, Cecilia Carolina Pinheiro daPara os ingredientes farmacêuticos ativos (APIs) que exibem baixa solubilidade e/ou estabilidade e/ou perfis de dissolução, dentre outros problemas capazes de afetar a sua eficácia terapêutica, as abordagens da Engenharia de Cristais têm se destacado nas últimas décadas como uma solução satisfatória. No estado sólido, os APIs podem apresentar polimorfos, sais, solvatos, co-cristais, amorfos e combinações dos mesmos. Associadas a cada estado sólido estão propriedades físicas e químicas, que podem ou não variar em relação ao API de referência. Neste contexto, este projeto de pesquisa visou o planejamento racional, síntese e caracterização de novas formas sólidas do pró-fármaco 5-fluorocitosina (5-FC) e do fármaco antineoplásico 5-fluorouracila (5-FU), ambos exibindo problemas fisicoquimicos que dificultam sua aplicação em formas de dosagem sólidas. Apesar de ser usado como fungicida, recentemente o 5-FC se tornou um dos pró-fármacos mais utilizados na terapia antineoplásica por meio de terapia dirigida por gene-enzima-pró-fármaco, uma vez que na presença da enzima citosina-desaminase o 5-FC é convertido em 5-FU dentro das células cancerosas. Para esta finalidade, coformadores adequados foram pre-selecionados a partir de análises estatísticas, realizadas utilizando o banco de dados estruturais da Cambridge, com base na competição entre sintons. Na sequencia, protocolos de cristalização foram desenvolvidos de acordo com duas técnicas: evaporação a partir de solvente e mecanoquímica, em particular a moagem com gota-solvente (SDG). Nove estruturas foram obtidas com 5-FC. Todas foram analisadas por microscopia óptica de luz polarizada e por difração de raios X por monocristal. Seis foram caracterizadas como co-cristais e três como sais. Sais farmacêuticos são preferidos nas formulações porque melhoram consideravelmente a solubilidade dos APIs. Co-cristais farmacêuticos têm sido cada vez mais explorados porque promovem igualmente melhorias nas propriedades físico-químicas dos APIs sem alterar a natureza dos mesmos. Os sais de 5-FC foram obtidos com os ácidos fumárico, oxálico e maleico e os cocristais com os ácidos adípico, tereftálico, málico, succínico e benzóico. Além disso, obteve-se um co-cristal multi-API, de 5-FC e 5-FU. Estes resultados, obtidos por meio do desenho racional de novas formas sólidas, concordaram bem com a regra de três, implementada para variações nos valores pKa (pKabase - pKaácido). Esta regra permite estimar a formação sais/co-cristais durante o processo de cristalização. Os sais de 5-FC foram analisados estrutural e termicamente. Os cocristais de 5-FC foram estruturalmente avaliados. O co-cristal multi-API também foi sintetizado por mecanoquímica, como parte dos esforços direcionados à aplicação dos princípios da Química Verde para a produção em larga escala de fármacos. Os resultados obtidos nesta tese oferecem um API como forte candidato a coformador, a saber a 5-FC, e introduz um co-cristal multi-API como potencial candidato para a terapia antineoplásica.Item Identificação e caracterização de novos agentes com propriedades anticâncer(2015-04-28) Magalhães, Luma GodoyCâncer é a denominação de um conjunto de mais de cem doenças causadas pelo crescimento e multiplicação desordenados de células anormais capazes de invadir e se disseminar por diversos tecidos e órgãos. É considerado um problema de saúde mundial, sendo uma das maiores causas de morte. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que 15% das mortes no mundo serão causadas por câncer em 2015. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 580 mil novos casos da doença para 2014. Apesar da vasta quimioterapia disponível, os tratamentos possuem alta toxicidade e estão sujeitos à resistência. Nesse contexto, a presente dissertação de mestrado tem como foco principal a identificação e caracterização de novos compostos com propriedades anticâncer. Os estudos foram realizados com base em dois alvos principais. O primeiro foi a proteína tubulina, um alvo anticâncer validado que é modulado por moléculas importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. O segundo alvo foi a migração celular, característica relacionada ao processo de metástase, que é responsável por 90% das mortes por câncer. Uma série de acridinonas sintéticas foi avaliada in silico frente à proteína tubulina empregando métodos de modelagem molecular. Para tanto, fez-se uso de estruturas cristalográficas da proteína disponíveis no PDB (Protein Data Bank). Os resultados das análises de docagem molecular indicaram que as moléculas poderiam interagir com o sítio da colchicina e, dessa forma, atuariam como inibidoras da polimerização dos microtúbulos. Ensaios wound healing e em câmara de Boyden permitiram a identificação de quatro compostos com potente efeito de inibição da migração celular (valores de IC50 variando entre 0,294 e 1,7 μM) em uma linhagem metastática (MDA-MB-231). Estes compostos foram submetidos a ensaios de citotoxicidade frente à mesma linhagem tumoral e também apresentaram boa potência, com valores de IC50 variando entre 0,110 e 3 μM. Além disso, ensaios de citotoxicidade em células saudáveis mostraram que estes compostos inviabilizaram seletivamente células tumorais. Para a validação dos estudos in silico, ensaios de polimerização da tubulina foram conduzidos. Os resultados mostraram que as quatro moléculas ativas nos ensaios celulares atuam como inibidores de polimerização dos microtúbulos, com valores de IC50 variando entre 0,9 e 13 μM. Estudos das relações entre a estrutura e atividade (SAR) revelaram alguns aspectos interessantes nesta série de acridinonas, como, por exemplo, a perda de atividade, que se deu tanto nos ensaios celulares quanto nos ensaios bioquímicos, causada pela substituição de um grupo nitro da posição meta- por para- em duas moléculas da série. A progressão do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo e os resultados mostraram que os compostos estudados são capazes de interromper o ciclo celular entre as fases G2 e M. A citometria fluxo também permitiu verificar a indução da apoptose celular devida à ação das moléculas. Em resumo, este trabalho possibilitou a identificação e caracterização de quatro compostos com propriedades antitumorais promissoras que serão utilizados como compostos líderes para posterior desenvolvimento como agentes anticâncer.Item Triagem biológica, identificação e planejamento de novos candidatos a agentes anticâncer a partir de produtos naturais e compostos sintéticos(2014-07-10) Altei, Wanessa FernandaCâncer é a denominação para um grupo de doenças devastadoras caracterizadas pelo crescimento e multiplicação descontrolados de células anormais que são capazes de invadir estruturas próximas e se espalhar por diversas regiões do organismo.Trata-se de um grande problema de saúde pública mundial, fazendo milhares de novas vítimas a cada ano. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), são estimados cerca de 580 mil casos novos da doença no Brasil para 2014. A presente tese de doutorado teve como foco principal a identificação e o desenvolvimento de novas moléculas com atividade anticâncer, através de triagens biológicas de compostos de origem natural e sintética, e do estudo das relações entre a estrutura e atividade (SAR). Triagens in vitro de derivados sintéticos do ácido gálico, ácido protocatecuico e guanidínicos, além de uma variedade de produtos naturais, possibilitaram a identificação de agentes inibidores da migração e proliferação de células tumorais metastáticas. Uma série de derivados sintéticos indólicos e espirocicloexadienonas, com potente efeito inibitório da migração celular, teve caracterizada a sua ação frente à proteína tubulina, alvo molecular de compostos importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. Ensaios de imunofluorescência revelaram a ação dos compostos associada a alterações do citoesqueleto celular. Também foram realizados o planejamento e a síntese de três cadeias peptídicas por meio da metodologia de síntese peptídica em fase sólida. Os resultados da avaliação biológica dos peptídeos indicaram o efeito de inibição na migração e proliferação de células tumorais de mama. Finalmente, estudos de metabolômica de duas linhagens tumorais de mama foram conduzidos através de análises de RMN do material celular cultivado.Item Planejamento de ligantes da tubulina com propriedades antitumorais(2011-12-07) Salum, Lívia de BarrosO planejamento de moduladores da dinâmica dos microtúbulos, a partir da ligação à αβ-tubulina, constitui importante estratégia para a terapia do câncer. Os efeitos de inibição da polimerização da tubulina ou de estabilização dos microtúbulos são promovidos pela interação de compostos em cavidades específicas da proteína alvo. A interferência com a dinâmica dos microtúbulos nas células em rápida multiplicação provoca o bloqueio do ciclo celular, disparando sinais bioquímicos que culminam em apoptose. Os taxanos são os agentes antimitóticos mais importantes dentre os estabilizadores de microtúbulos, ao passo que os alcalóides da vinca e a colchicina são membros representativos dos inibidores da polimerização. Entretanto, o aparecimento de resistência, baixa biodisponibilidade e reações adversas graves são fatores que têm impulsionado a pesquisa por novos agentes anticâncer. Dentre os ligantes identificados recentemente para o sítio do taxol, o discodermolídeo e a dictiostatina, produtos naturais de origem marinha, são potentes estabilizadores de microtúbulos que apresentam maior solubilidade que o taxol e atividade contra células de câncer resistentes aos taxanos. Por essa razão, o modo de ligação desses compostos à cavidade de interação da β-tubulina tem sido objeto de investigação. Modelos preditivos de HQSAR foram desenvolvidos para derivados sintéticos do discodermolídeo e utilizados em conjunto com estudos baseados na estrutura do receptor, em concordância com evidências experimentais, para a proposição de modelos de interação para os análogos na cavidade do taxol. Os modelos de conformação bioativa foram utilizados no alinhamento estrutural do conjunto de dados para estudos de QSAR 3D CoMFA e comparação com o alinhamento baseado nas estruturas minimizadas dos ligantes. A caracterização de padrões de reconhecimento molecular foi útil para a proposição de um modelo farmacofórico baseado nas estruturas dos produtos naturais estabilizadores de microtúbulos. Um modelo farmacofórico simplificado foi integrado ao processo de triagem virtual consistindo na aplicação de filtros hierárquicos sucessivos para a identificação de novos estabilizadores de microtúbulos. Caseobliquinas foram ensaiadas como estabilizadoras de microtúbulos, enquanto que intermediários sintéticos da dictiostatina foram avaliados quanto aos seus efeitos na polimerização da tubulina. Nos últimos anos, tem sido intensificada a busca por novos ligantes do sítio da colchicina, dentre os quais os indóis estão entre os mais relevantes. Para quatro conjuntos de dados totalizando 170 derivados de indóis, modelos de HQSAR foram desenvolvidos para a avaliação virtual de uma base de dados. Estudos de QSAR 3D CoMFA e CoMSIA baseados nos farmacóforos foram comparados para 3 conjuntos de dados. Os resultados sugerem que o núcleo indólico pode interagir de maneiras diferentes na cavidade de interação da proteína. Chalconas do tipo 1, inspiradas em ligantes clássicos do sítio da colchicina, foram avaliadas em ensaios celulares e de polimerização da tubulina, levando a síntese e avaliação de uma nova série de chalconas com propriedade antiproliferativa significativa. Por outro lado, derivados de N-acil-hidrazonas apresentaram atividade antimitótica semelhante à colchicina, enquanto as tiosemicarbazonas citotóxicas não interagiram diretamente com a tubulina.Item Identificação de novos inibidores da migração celular em células de câncer de mama e próstata(2009-01-30) Stevanatto, Karime BittarCâncer é a proliferação descontrolada de células anormais do organismo. As células cancerosas podem se transferir para outras partes do corpo onde passam a crescer e substituir o tecido sadio, num processo conhecido como metástase. De um total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo em 2007, o câncer foi responsável por 7,6 milhões. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo, sendo o mais comum entre as mulheres. A cada ano, cerca de 20% dos novos casos de câncer em mulheres são de mama. No que diz respeito a valores absolutos, o câncer de próstata é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo e o mais prevalente em homens, representando cerca de 10% do total. As principais formas de tratamento são a cirurgia, quimioterapia, radioterapia, hormonioterapia, imunoterapia e as terapias-alvo. Os tratamentos quimioterápicos e radioterápicos, principalmente, possuem baixa seletividade em sua ação frente a células malignas e benignas. O presente trabalho de dissertação tem como objetivo o desenvolvimento de testes in vitro, como o wound healing e o de migração, empregando células de adenocarcinoma mamário humano (MDA-MB-231) e de câncer de próstata humano (DU-145), além da triagem biológica de compostos químicos visando à identificação de novos candidatos a inibidores do processo de migração celular (metástase). Os protocolos experimentais foram estabelecidos e padronizados com sucesso, fornecendo resultados reprodutíveis, confiáveis e validados. Após extensivas triagens biológicas, duas classes de candidatos a inibidores foram identificadas.Item Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática(2008-07-04) Gonçalves, Daniele Fernanda ChiarelliA DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer.