Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Caracterização bioquímica, biofísica e estrutural da Celobiohidrolase I de Trichoderma harzianum envolvida na hidrólise da biomassa lignocelulósica(2012-12-12) Colussi, FrancieliDevido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI.Item Caracterização estrutural da Glicosilhidrolase de Xanthomonas campestris contendo os domínios: catalítico da família GH 5 e domínio similar a Expansina(2012-10-18) Tomazini Junior, AtílioA demanda global por energia tem acompanhado o desenvolvimento de novas indústrias, o que exige um constante aprimoramento e busca por novas fontes de energia. Com a conscientização da população a respeito da necessidade de fontes de energia renovável se abriu uma expectativa otimista para o uso da biomassa como fonte de energia. Uma variedade de microrganismos, como bactérias e fungos produzem enzimas que podem ser usadas para a despolimerização de biomassa celulósica em monômeros de glicose. Dentro deste contexto, estudamos uma celulase (XCC3535) de Xanthomonas campestris. Esta proteína é um híbrido natural com dois domínios (um domínio glicosilhidrolase e um domínio semelhante à expansina) que podem possuir funções complementares. Acredita-se que expansinas e proteínas semelhantes a expansinas possam ajudar na degradação da celulose cristalina, participando na ligação ao substrato, seguida pela formação de complexos enzimáticos ou, possivelmente, associadas à superfície para degradação. Este trabalho foi iniciado com análises de bioinformática da sequência para a proteína Glicosilhidrolase permitindo três construções para clonagem : uma completa contendo ambos os domínios (catalítico e semelhante a Expansina), outro com apenas o domínio catalítico GH5, e uma terceiro com apenas o domínio semelhante a Expansina. Obtemos por expressão recombinante em Escherichia coli Rosetta proteína das três construções. A amostra protéica pura foi utilizada para estudos por espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), dicroísmo circular (CD) e cristalização para uso aplicando difração de raios-X. Assim, nosso principal objetivo neste estudo foi a descrição da Glicosilhidrolase XCC3535, permitindo assim a geração de conhecimento para o entendimento da função desta proteína e de seus domínios.