Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
URI permanente para esta coleçãohttp://143.107.180.6:4000/handle/RIIFSC/9
Navegar
2 resultados
Resultados da Pesquisa
Item Estudos estruturais e funcionais da única enzima diadenilato ciclase e da única YbbR-like de Staphylococcus aureus: proteínas envolvidas na biossíntese de c-di-AMP(2016-10-31) Mesquita, Nathalya Cristina de Moraes RosoRecentemente, uma nova molécula de sinalização bacteriana, o AMP dimérico cíclico (c-di-AMP) emergiu como um regulador central dos processos fisiológicos essenciais, tais como a homeostase celular, verificação da integridade do DNA e virulência bacteriana, entre outros. O c-di-AMP é produzido a partir da condensação de duas moléculas de adenosina trifosfato (ATP) por proteínas denominadas diadenilato ciclases, que contém o domínio DisA_N, também denominado DAC. Existem 2842 sequências de proteínas que contém o domínio DAC, provenientes de 2386 organismos encontradas no banco de dados Protein Families Database (Pfam). Essas proteínas são divididas em subfamílias sendo as três subfamílias mais abundantes: DacA (69,1%), proteínas de membrana associadas a sinalização intracelular de alterações decorrentes do meio externo; DisA (24,1%), primeira diadenilato ciclase a ser amplamente estudada, é uma proteína intracelular encontrada na forma de octâmeros ativos em solução, a qual, indiretamente, controla a divisão celular através da verificação da integridade do DNA e DacB (5,5%), proteínas citoplasmáticas expressa, particularmente, durante a formação de esporos bacterianos. Uma característica interessante é que a maioria dos organismos contém uma única e essencial proteína com domínio DAC. Os organismos que contém duas ou mais proteínas-DAC, tais como Clostridium e Bacillus spp., são uma exceção. Em Staphylococcus aureus (S. aureus), um patógeno humano oportunista e responsável por inúmeras doenças infecciosas, uma única diadenilato ciclase é encontrada pendurada na porção interna da membrana celular (Sau_DacA). A atividade desta proteína é potencialmente regulada através da interação direta com uma proteína YbbR-like, que contém um domínio sensor extracelular. Sau_DacA conserva todos os elementos-chave de uma diadenilato ciclase bacteriana, e por ser a única presente em S. aureus, revela-se um excelente alvo de estudo para o desenvolvimento de novos fins terapêuticos. No entanto, até o presente momento, existem poucas informações em relação a estrutura proteica, ao mecanismo de síntese de c-di-AMP e regulação do mecanismo de síntese de nucleotídeo destas proteínas, sendo, portanto, neste aspectos que o presente trabalho pretendeu contribuir. Através de uma série de ensaios, estruturais, calorimétricos, espectroscópicos e bioquímicos, aliados a mutações sítio-dirigidas, identificou-se a relevância de uma conformação dimérica para a estabilidade conformacional e térmica para a proteína ser funcionalmente ativa, assim como a importância dos motivos conservados DGA (Aspartato-Glicina-Alanina) e RHR (Arginina-Histidina-Arginina) para a atividade da Sau_DacA. O loop L5 localizado entre o sítio ativo e a interface dimérica mostrou-se relevante, uma vez que nele é encontrado o motivo DGA - de ligação ao ATP - e o mesmo encontra-se estabilizado em uma posição favorável para ligação do ATP, apenas na conformação dimérica da proteína. Nossos resultados aliados a dados da literatura possibilitaram a proposição de um mecanismo de síntese de c-di-AMP que deve ocorrer via encontro face-a-face de dois sítios de ligação de ATP presentes em dímeros proteicos distintos, podendo a taxa de síntese de o nucleotídeo sofrer interferência via interação proteína-proteína com a proteína receptora de sinal Sau_YbbR. Desta forma, contribuímos para uma melhor compreensão da estrutura e função da Sau_DacA, possibilitando o uso desta como alvo para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que é sabido que a biossíntese de c-di-AMP é essencial para a maioria dos patógenos que o sintetizam.Item Estudos da correlação estrutura-função da enzima Clorocatecol 1,2-Dioxigenase de Pseudomonas putida(2012-05-03) Mesquita, Nathalya Cristina de Moraes RosoO intenso uso de compostos orgânicos em conjunto com o grande avanço industrial culminou em um enorme acúmulo de poluentes orgânicos no meio ambiente. Dentre estes poluentes têm-se destacado a presença de hidrocarbonetos aromáticos altamente tóxicos e resistentes à degradação física, química, fotolítica e biológica. Desta maneira, uma nova forma de combater a presença deste tipo de composto no meio ambiente têm sido estudada: o uso de microorganismos, naturais ou geneticamente modificados, capazes de transformá-los em substâncias inertes, como CO2 e água. Tal metodologia é denominada biorremediação. Dentres estes microorganismos destacam-se bactérias dos gêneros Pseudomonas, Aeromonas, Beijerinckia, dentre outros, que têm sido estudadas para esta finalidade. A enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD) é uma das proteínas expressas por bactérias do gênero Pseudomonas putida, sendo responsável pela clivagem de hidrocarbonetos aromáticos através da incorporação de ambos os átomos de uma molécula de oxigênio à estrutura do anel aromático, sendo a proteína escolhida para desenvolvermos o presente trabalho. Mais especificamente, nos interessa estudar como o mecanismo de ação da referida enzima é controlado por moléculas extrínsecas, como fosfolipídios. Tal interesse pela interação entre a enzima e fosfolipídios surgiu recentemente quando da obtenção da primeira estrutura cristalográfica de uma enzima da família da CCD (dioxigenases intradióis). Nesta estrutura foi observado um sítio de ligação por monômero para fosfolipídios, o que fez com que várias questões relativas à influência desses sobre a atividade da enzima fossem levantadas. Nosso objetivo foi fazer uso das técnicas de Dicroísmo Circular (CD), Calorimetria e Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) para estudar alterações conformacionais da enzima e de sua cinética induzidas por moléculas de fosfolipídio, e assim, obter informações que correlacionem as mudanças estruturais com o mecanismo de atividade enzimática da enzima. Os resultados obtidos através do uso daquelas técnicas em conjunto com protocolos que possibilitam a delipidação da enzima mostraram que a presença do fosfolipídios na estrutura da enzima tem influência sobre a atividade enzimática. Quando retiramos o fosfolipídio/ácido graxo, pudemos visualizar uma pequena mudança na estrutura secundária da enzima, um aumento da entalpia de reação, bem como um aumento na velocidade de reação, enquanto que a afinidade da enzima pelo substrato diminuiu. Pudemos também observar uma maior estabilidade térmica da enzima quando na ausência do fosfolipídio/ácido graxo e não foi observado interação da Pp 1,2-CCD com modelos micelares constituídos por lisofosfolipídios. Um breve estudo realizado sobre o papel da força iônica na atividade e na estabilidade térmica da proteína mostrou que na ausência de NaCl, em pH 8, a enzima se mostrou mais ativa, com uma afinidade pelo substrato maior e neste ambiente com baixa força iônica foi observado uma pequena interação da enzima com modelos micelares carregados negativamente. Assim, pudemos concluir que as moléculas anfipáticas, retiradas com os processos de delipidação, apesar de modificarem muito pouco a estrutura secundária da enzima, ainda assim instauram modificações na sua função de catálise do substrato catecol. Esta informação juntamente com os dados sobre inibição do processo reacional ocasionada pelo produto da reação formam um novo conjunto de dados que pode ser utilizado para se alcançar o objetivo mais geral de se controlar a atividade biológica da Pp 1,2-CCD.