Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Estudo da interação entre ácidos graxos e Lys49-fosfolipases A2 por difração de raios X e ressonância magnética nuclear(2014-12-05) Ambrósio, André Luís BerteliFosfolipases A2 (PLA2; E.C. 3.1.1.4) constituem uma família de enzimas amplamente estudada com o objetivo de se caracterizar as bases estruturais de suas propriedades tóxicas e catalíticas. Nos últimos anos, muita atenção tem sido direcionada às PLA2 miotóxicas e cataliticamente inativas (classe II, ~ 15 Kda), nas quais um dos ligantes do cofator Ca2+, o resíduo Asp49, é sistematicamente substituído por uma lisina. Estudos recentes mostram que essas variantes apresentem atividade catalítica limitada, uma vez que um dos produtos, uma molécula de ácido graxo, não deixa o sítio ativo após a catálise, devido à presença da Lys122 que de maneira indireta, segura eletrostaticamente o grupo acídico desta molécula. Cristais da Miotoxina ACL (extraída do veneno da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus), crescidos no grupo espacial P41212, foram obtidos em três condições diferentes. Dados de difração de raios X para cristais das primeiras e segundas formas foram coletados usando radiação síncrotron na linha PCr do LNLS e para cristais da terceira forma foram coletados no sistema de ânodo rotatório ultraX 18 em nosso laboratório. O processamento dos dados foi realizado e uma solução para a substituição molecular das duas primeiras formas foi encontrada usando a também Lys49-PLA2 da serpente Agkistrodon p. piscivorus como modelo de busca. Para resolução da terceira forma foram usadas informações do espalhamento anômalo dos átomos de enxofre da molécula, com dados coletados à um comprimento de onda correspondente a radiação Kα do cobre. Ciclos sucessivos de refinamento, tanto no espaço recíproco como no real, foram realizados, e a existência de uma densidade eletrônica dentro do sítio ativo na forma I sugere a presença de uma molécula de ácido graxo, não observada nas outras duas formas. Comparações entre as três formas demonstram que modificações envolvendo o loop de ligação de cálcio e o C-terminal são as responsáveis pelas diferenças estruturais principais, uma vez que nas duas últimas formas, a His33 ocupa o lugar da Lys122 na primeira forma e o Trp31 oclui parcialmente o sítio de ligação do ácido graxo. Essa é a primeira vez que são observadas três formas estruturalmente diferentes para uma Lys49-PLA2. Neste trabalho propomos um mecanismo relacionando a retenção do ácido graxo com mudanças conformacionais associadas à danos em membranas e miotoxicidade