Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Estudo da interação entre ácidos graxos e Lys49-fosfolipases A2 por difração de raios X e ressonância magnética nuclear(2014-12-05) Ambrósio, André Luís BerteliFosfolipases A2 (PLA2; E.C. 3.1.1.4) constituem uma família de enzimas amplamente estudada com o objetivo de se caracterizar as bases estruturais de suas propriedades tóxicas e catalíticas. Nos últimos anos, muita atenção tem sido direcionada às PLA2 miotóxicas e cataliticamente inativas (classe II, ~ 15 Kda), nas quais um dos ligantes do cofator Ca2+, o resíduo Asp49, é sistematicamente substituído por uma lisina. Estudos recentes mostram que essas variantes apresentem atividade catalítica limitada, uma vez que um dos produtos, uma molécula de ácido graxo, não deixa o sítio ativo após a catálise, devido à presença da Lys122 que de maneira indireta, segura eletrostaticamente o grupo acídico desta molécula. Cristais da Miotoxina ACL (extraída do veneno da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus), crescidos no grupo espacial P41212, foram obtidos em três condições diferentes. Dados de difração de raios X para cristais das primeiras e segundas formas foram coletados usando radiação síncrotron na linha PCr do LNLS e para cristais da terceira forma foram coletados no sistema de ânodo rotatório ultraX 18 em nosso laboratório. O processamento dos dados foi realizado e uma solução para a substituição molecular das duas primeiras formas foi encontrada usando a também Lys49-PLA2 da serpente Agkistrodon p. piscivorus como modelo de busca. Para resolução da terceira forma foram usadas informações do espalhamento anômalo dos átomos de enxofre da molécula, com dados coletados à um comprimento de onda correspondente a radiação Kα do cobre. Ciclos sucessivos de refinamento, tanto no espaço recíproco como no real, foram realizados, e a existência de uma densidade eletrônica dentro do sítio ativo na forma I sugere a presença de uma molécula de ácido graxo, não observada nas outras duas formas. Comparações entre as três formas demonstram que modificações envolvendo o loop de ligação de cálcio e o C-terminal são as responsáveis pelas diferenças estruturais principais, uma vez que nas duas últimas formas, a His33 ocupa o lugar da Lys122 na primeira forma e o Trp31 oclui parcialmente o sítio de ligação do ácido graxo. Essa é a primeira vez que são observadas três formas estruturalmente diferentes para uma Lys49-PLA2. Neste trabalho propomos um mecanismo relacionando a retenção do ácido graxo com mudanças conformacionais associadas à danos em membranas e miotoxicidadeItem Determinantes estruturais da interação entre PPARy e o ácido ajulêmico e bases do reconhecimento molecular entre HIV-1 integrase e o coativador transcricional p75(2014-02-21) Ambrósio, André Luís BerteliÁcido ajulêmico (AJA) é um análogo sintético do ácido THC-11-óico, um metabólito do composto tetrahidrocanabinol (THC), principal ingrediente ativo da maconha, uma droga derivada da planta cannabis sativa. A principal característica do composto AJA é que este apresenta potentes efeitos analgésico e antiinflamatório, sem a ação psicotrópica do THC. AJA não é ulcerogênico em doses terapêuticas e encontra-se atualmente na fase I de testes clínicos, apesar de seu mecanismo de ação não ser completamente entendido. Vários estudos têm reportado que AJA se liga de maneira direta a isoforma da família PPAR de receptores nucleares, induzindo sua atividade transcricional em modelos humanos e em ratos, quando administrado em concentrações farmacológicas. Atualmente AJA se encontra em fase I de testes clínicos, sob aprovação do FDA (Food and Drug Adminstration, E.U.A.). Neste trabalho, é determinada e analisada a estrutura cristalográfica do complexo PPAR -LBD:AJA, mostrando que de fato este receptor pode ser o (ou um) mediador da ação terapêutica de AJA in vivo. Na segunda parte da tese é apresentada da estrutura cristalográfica com complexo entre o domínio catalítico da integrase de HIV e parte do coativador transcricional p75 (também conhecido como LEDGF), mostrando as bases estruturais do reconhecimento molecular no hospedeiro por enzimas retrovirais, passo esse crucial para a replicação viral. Tal importância tem sido explorada no desenvolvimento de fármacos anti-retrovirais, que possam inibir o passo de integração do cDNA viral no genoma humano, atacando o sítio ativo da enzima Devido a características da interface observada no modelo cristolográfico, sugerimos tal região pode vir a ser um novo alvo no desenho de pequenas moléculas que interfiram no reconhecimento molecular