Teses e Dissertações (BDTD USP - IFSC)
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Item Estudos estruturais e bioquímicos das septinas 7 e 9 humanas(2010-06-16) Alessandro, FernandoAs proteínas pertencentes à família das septinas foram originalmente descobertas em 1971 em decorrencia de estudos genéticos em células mutantes. Essas proteínas encontradas em fungos e animais, mas não em plantas apresentam como principais características a presença de um domínio conservado de ligação aos nucleotídeos de guanina (GTP) e a formação de filamentos homo- e hetero-oligoméricos, que são estruturas altamente organizadas. Estudos filogenéticos e moleculares em humanos identificaram 14 septinas que são divididas em 4 grupos (I, II, III e IV). Estas moléculas associam-se com membranas celulares, actina, microtúbulos do citoesqueleto e estão envolvidas em inúmeros processos que ocorrem no córtex celular e requerem organização espacial, tais como: citocinese, ciclo celular, formação de barreiras de difusão, alinhamento de fuso. Alterações na expressão das septinas estão associadas a vários tipos de tumores e a doenças de Parkinson e Alzheimer. Neste trabalho, com o objetivo de obter informações estruturais e bioquímicas das septinas 7 e 9 humanas. Este projeto é parte de um esforço conjunto coordenado pelo Prof. Dr. Richard C. Garratt e conhecido informalmente como Septimoma. As construções recombinantes SEPT 7, SEPT 7G, e SEPT 9G foram expressas em Escherichia coli e as proteínas recombinantes obtidas. As análises em eletroforese SDS-Page e em gel nativo indicam que essas proteínas foram purificadas com sucesso. A atividade GTPase e o estado oligomérico na forma dimérica foram verificados. Estudos de dicroísmo circular e fluorescência determinaram que esses recombinantes são formados por uma mistura de estruturas secundárias &alfa; e β, e também que o C e o N terminais aumentam a estabilidade das proteínas. Foram obtidos cristais da SEPT 7G e, por meio da técnica de raios-X, foi determinado um modelo tridimensional da proteína com resolução de 3,4o.Item Purificação e caracterização estrutural de um inibidor de serinoprotease isolado de sementes de Cassia leptophylla.(2008-09-10) Alessandro, FernandoInibidores de proteases - moléculas capazes de inibir a atividade catalítica de enzimas proteolíticas - compreendem uma das mais abundantes classes de proteínas em plantas. Nas sementes, as funções destas moléculas estão relacionadas com o controle de proteínas endógenas e com mecanismo de defesa contra insetos fitófagos. Este trabalho teve como objetivo isolar, purificar, caracterizar estruturalmente e testar algumas aplicações biotecnológicas de um inibidor de serinoprotease das sementes de Cassia leptophylla. Após extração salina, a partir de cotilédones de sementes secas, o inibidor foi purificado por meio de cromatografia de filtração molecular sobre coluna Superdex75 e cromatografia de troca iônica em uma coluna Mono-Q. A proteína purificada apresentou PI de aproximadamente 4,5 e massa molecular estimado por eletroforese (SDS-PAGE) de 20kDa, sendo constituída por duas cadeias polipeptídicas de l6kDa e 4kDa. A seqüência N-terminal da cadeia de 4kDA (ATEDEKKDLGISIDDCCNRRLVVK) revelou similaridade com outros inibidores de serinoproteases tipo Kunitz isolados de Adenanthera pavonina, Prosopsis juliflora e Acacia confusa; o inibidor em estudo foi denominado CLTI (Cassia 1eptophyZZa trypsin inhibitor). A investigação da seqüência N-terminal da cadeia de 16 kDa, por meio da degradação de Edman automatizada, não deu sinal positivo, indicando provável bloqueio do primeiro resíduo de aminoácido. O espectro de dicroísmo circular (CD) do inibidor revelou que os componentes de estrutura secundária são constituídos predominantemente de folhas-β, voltas e estruturas não ordenadas. O espectro de emissão de fluorescência deste inibidor apresentou máximo de emissão em 226 nm, típico de proteínas com os resíduos de triptofano protegidos do solvente. CLTI quando submetido a pHs extremos (ácidos e básicos) revelou alterações de estrutura secundária e foi estável até cerca de 55°C (temperatura de transição 59°C), ambos investigados por CD e emissão de fluorescência. Ensaios de atividade biológica in vitro revelaram que CLTI inibiu a coagulação de plasma humano citratado, a ação das enzimas tripsina (KI 1,92μM), quimotripsina (KI 14,5μM), e calicreína plasmática humana (KI 1,5μM), mas não apresentou inibição sobre elastase porcina. CLTI formou um complexo estável com a tripsina demonstrado pela eluição do mesmo em coluna de filtração molecular. Este inibidor também mostrou atividade fungicida sobre as cepas de Fusarium monifome e Fusarium gramineanim e atividade fungistática sobre as cepas de Colletotrichum sp. F37 e Colletotrichum sp. P10.