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Item The sugarcane EST project(2017-05-29) Thiemann, Otavio HenriqueA cultura da cana-de-açúcar representa uma importante parcela da atividade agroindustrial do país bem como do estado de São Paulo. Sua importância econômica é significativa, sendo a cana essencial na produção açucareira e do álcool e também na composição de forragem animal. As espécies atualmente cultivadas são o resultado de diversos cruzamentos interespecíficos e da manipulação humana. Resulta disso um genótipo complexo que torna o mapeamento dos caracteres desejáveis para o melhoramento genético uma tarefa difícil. O sequenciamento de ESTs (Expression Sequence Tags) de diferentes órgãos vegetais se mostra como uma via apropriada para o mapeamento do genoma vegetal e da expressão gênica diferencial em diversos tecidos. O propósito deste projeto de pesquisa é a colaboração no esforço de sequenciamento de ESTs que será realizado pelo consórcio de laboratórios ONSA-SUCEST. Este projeto não somente objetiva a realização do sequenciamento para levar a cabo as metas do consórcio, mas também o estabelecimento da tecnologia de sequenciamento em larga escala, tão importante para o perfil da ciência biomédica nacional e internacional. Os resultados obtidos nos diversos esforços de natureza semelhante são testemunho da importância de tais projetos para o avanço do conhecimento científico e para futuras aplicações biotecnológicas.Item Emprego de ensaios de HTS na identificação de compostos guia de produtos naturais e abordagens de planejamento racional de fármacos a alvos selecionados de doenças parasitárias(2017-05-29) Thiemann, Otavio HenriquePara a descoberta de novos compostos biologicamente ativos contra doença é necessária à avaliação de um grande número de extratos e compostos puros através de ensaios biológicos ou bioquímicos. A probabilidade de identificar novos compostos bioativos depende do número e diversidade química das amostras avaliadas, além da especificidade dos ensaios. Após a identificação de uma nova molécula bioativa, a caracterização estrutural e das interações enzima alvo-ligante se faz necessária para a otimização de propriedades farmacodinâmicas. Esses estudos requerem a construção de bases de dados de compostos e o uso de métodos computacionais avançados em química medicinal. A presente proposta tem como objetivo a implementação de ensaios bioquímicos em larga escala, do inglês High-Throughput Screening (HTS), usando sistemas automatizados que requerem pequenos volumes de amostras. Estes ensaios em larga escala serão muito úteis no esforço global da rede BioprospecTa. O gerenciamento de bases de dados de compostos, onde a informação química/estrutural e biológica estará classificada e organizada, irá permitir a aplicação de métodos avançados em química medicinal computacional para o planejamento de novas moléculas bioativas candidatas a protótipos de novos fármacos. Atualmente, estudos envolvendo a triagem bioquímica de compostos puros de origem natural e sintética e de extratos é realizado em colaboração com os laboratórios de química de produtos naturais do Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira (DQ-UFSCar), Prof. Dr. Roberto Gomes de Souza Berlinck (DFQ-IQSC) e Profa. Dra. Monica Tallarico Puppo (FMRP). O objetivo principal do laboratório é o desenvolvimento de pesquisa aplicada e fundamental, assim como de desenvolvimento tecnológico. Este esforço é focado nas áreas de planejamento molecular baseado em estruturas, especificamente e diretamente relacionado à iniciativa da rede BioprospecTa.Item Purine synthesis pathway and identification of novel genes(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueWe are currently involved as a sequencing laboratory in the SUCEST project. Our Data Mining purpose is to search the EST database generated from the SUCEST effort in two themes: the first is the identification of genes involved in the purine synthesis and recycling pathways. The second theme of our data mining effort is an exploratory analysis of those EST sequences whose identity is unknown from the first database searches, the so called “no hit sequence". The purine nucleotide pathways are of central importance to all living organisms and have been investigated as a possible target for chemotherapy due to differences between the disease agents and their hosts. In human cells the purine nucleotides are synthesized from non-nucleotide precursors such as amino acids, ammonia and carbon dioxide. Purines can also be recycled through the salvage pathway. Another important enzyme involved in the salvage as well as de novo pathway is the enzyme responsible for the synthesis of the PRPP substrate, PRPP synthetase (PRS), utilized in all PRTases reactions. The knowledge of sugarcane purine synthesis enzymes will open the possibility of using such enzymes as a target for drugs to combat phytopathogen agents, as is being done with several parasitic targets. With our participation in the project as a sequencing laboratory, we have initiated a preliminary Data Mining effort using the following strategy. Representative enzyme sequences for each member of the purine de novo synthesis and recycling pathways have been chosen from the NCBI database. Those peptide sequences are being used to search the entire translated SUCEST database using the BLAST facility available. Retrieved EST clones are further tested for the statistical significance of the alignment by a Monte Carlo shuffling algorithm. To calibrate the Monte Carlo analysis, known protein sequences of divergent rate along the phylogenetic three have been used. Those sequences are compared to each other and to the EST clones. The resulting table of p-values indicates the degree of divergence of each enzyme along different rate and with the Sugarcane EST clones. Preliminary results employing this strategy allowed us to identify at least one potential case of polymorphism in Sugarcane, of the protein PRPP synthetase, a key enzyme of the purine synthesis pathway. Interestingly, two important genes, glutamine-PRPP-amidotransferase and GAR transformylase, from the de novo synthesis pathway have not been found in the SUCEST database so far. Those missing genes pose interesting questions that may be further investigated, such as if those genes are of such low abundance as to be undetected in the current libraries. Alternatively glutamine-PRPP-amidotransferase and GAR transformylase y be so divergent as to avoid detection in our search strategy. The possibility that Sugarcane would employ an alternative purine metabolism is unlikely since all the other enzymes involved have been identified with high degree of similarity to the known sequences. In every genome effort undertaken to date a variable number of unidentified sequences are encountered. Those genes are of great interest since they may be responsible for important and yet unknown pathways of the organism studied. The EST genome sequencing effort of the sugarcane plant isn't an exception. Several EST sequences are being accumulated as “no hit sequences" that aren't initially identified by the standard method of search employed. Our purpose is to analyze as many as possible of those sequences in an attempt to identify sequences with marginal similarity scores. Although such undertaking is laborious and will not permit the detailed examination of all the unknown sequences, we may be able to identify if potentially valuable information is being lost as "no Hit sequences". If such is the case, it would justify further efforts to develop automatic search methods to explore those sequences. The strategy employed will be of collecting individual sequences and perform database searches, against the public databases, using the translated peptide sequence as query. Such approach is known to increase the sensitivity of the search and return more reliable results. Marginal identities will be further analyzed by statistical methods, such as the Monte Carlo algorithm, and phylogenetic reconstruction if the sequence length permits. The identified sequences will be made available for further study by the data mining laboratory working on the pathway specific to it or will be catalogued for further analysis.Item Caracterização molecular e estrutural do Leishmania RNA vírus LRV1-4(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueAlém do inegável impacto em saúde humana e de animais domésticos, o estudo dos protozoários (Reino Protista) é de grande relevância pela diversidade de espécies, muitas ainda desconhecidas, e sua importância evolutiva no surgimento de eucariotos. Desta forma, o estudo de diversos aspectos da biologia de protozoários, parasitas ou não, se justifica. O Leishmania RNA vírus 1-4 (LRV1-4) é um vírus classificado como pertencente a família Totiviridae. Possui capsídeo icosaédrico de genoma composto por RNA de dupla fita (dsRNA) que codifica duas proteínas, uma capsidial e uma RNA polimerase. Sendo pouco estudado, mas com indicação de ter relevancia na invasão celular de Leishmania, iniciamos a caracterização molecular deste vírus com o objetivo de empreender estudos estruturais e funcionais. Dados recentes indicam o envolvimento do LRV1-4 na patogênese de Leishmania no hospedeiro humano, tornando seu estudo de fundamental importância para o entendimento dessa doença e de seu papel na relação parasito-hospedeiro. Trabalhos recentes desenvolvidos por nosso laboratório resultaram no estabelecimento de uma metodologia de purificação de partículas de LRV1-4 com o qual obtivemos imagens inéditas de Microscopia Eletrônica de Varredura do capsideo. Na presente proposta, com base nos procedimentos já estabelecidos, daremos continuidade aos estudos de Microscopia Eletrônica de Varredura por Negative Staining e Crio-Microscopia Eletrônica, caracterização molecular e estrutural do capsideo viral extraído de células infectadas de Leishmania guyanensis e de caspideos recombinantes expressos em Leishmania tarentolae. Os estudos aqui propostos deverão permitir a construção de um modelo estrutural do capsídeo do LRV1-4 e contribuir no entendimento do processo de replicação, a confirmação (ou não) dentre os Totiviridae e o seu papel na relação parasito-hospedeiro. Além das contribuições ao conhecimento da biologia/patogenia do LRV1-4 este estudo representa a primeira caracterização estrutural de um capsideo viral realizada no Brasil e assim um avanço importante para a área de virologia e biologia estrutural no pais.Item Biossíntese de selenocisteína: estudos estruturais e validação por RNAi(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueA via de síntese do 21° aminoácido (selenocisteina - Sec - U) representa a principal forma biológica de selênio. A sua síntese e incorporação em selenoproteínas depende de um códon de terminação UGA em fase e uma estrutura terciária do mRNA (SECIS). Recentemente identificamos a existência da via de síntese de selenocisteínas e os respectivos genes para SELE, SELD, PSTK, SECp43 e os tRNASerSec (SeIC) em todos os Kinetoplastida. Um gene candidato a selenoproteína, Sell foi identificado em L. major e L. infantum. Em Kinetoplastida esta via representa um alvo em potencial no estudo do mecanismo de interação e especificidade entre proteínas e tRNAs bem como uma possível via para desenho de inibidores. A cristalização e determinação da estrutura 3D dos componentes desta via de Kinetoplastida (Leishmania major e Trypanosoma brucei) bem como a validação desta via como potencial alvo para o desenho de inibidores por técnica de RNA de interferência são os objetivos principais deste projeto.Item Aplicação dos princípios de evolução in vitro em estudos de função e estrutura da hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase de Leishmania tarentolae(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueAs leishmanioses estão dentre as mais devastadoras doenças humanas. Entretanto não se possui uma medida de tratamento eficiente e segura dos indivíduos infectados. Estes organismos se destacam por serem auxotróficos para purinonucleotídeos. Com a finalidade de desenvolver novas formas de quimioterapia, a via de recuperação se apresenta como uma ideia candidata a esse fim. Objetivando complementar a pesquisa em andamento pretendemos empregar técnicas de evolução in vitro (DNA shuffling) para a seleção de mutantes do gene HGPRT de Leishmania. Esses serão sequenciados e estudos cinéticos serão realizados. As enzimas mutadas poderão ser posteriormente cristalizadas e sua estrutura resolvida. Esta informação levará a um melhor entendimento do mecanismo de catálise e ao desenho de inibidores.