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Item Estudos estruturais de endopeptidases glutamato-especificas, proteínas envolvidas no metabolismo de amino-acucares e a proteína de reserva 25: modelagem molecular e cristalografia(2017-05-29) Garratt, Richard CharlesEste projeto tem como finalidades a modelagem molecular de vários endopeptidases glutamato-específicas (EGE's) e a purificação de uma delas (a EGE de Bacillus licheniformis, GSE-BL) visando à determinação da sua estrutura tridimensional. Estas enzimas são parentes distantes da família tripsina de serino-proteases, e através das estruturas tridimensionais desenvolvidas no projeto pretende-se entender melhor a base estrutural da sua especificidade incomum, bem como o mecanismo molecular da síndrome da pele queimada ("Staphyloccoal Scalded Skin Syndrome") causada pelas toxinas epidermolíticas que são moléculas homólogas. A enzima purificada também tem aplicações na área de seqüenciamento de proteínas, pois a enzima equivalente que é tradicionalmente utilizada para fragmentação de proteínas (a protease V8 de S. aureus) é extremamente cara. A alta atividade da EGE de B. licheniformis em comparação com a protease V8 sugere que ela poderá substituí-la para esta finalidade.Item Septinas: estudos comparativos visando correlacionar estrutura e função(2017-05-12) Garratt, Richard CharlesA presente proposta foca aspectos estruturais e funcionais da família das septinas utilizando uma abordagem integrada composta por uma série de técnicas biofísicas e celulares. Embora descritos pela primeira vez em levedura a cerca de 40 anos atrás, onde são essenciais para completar o ciclo celular, septinas ainda são consideradas um componente do citoesqueleto neglegenciado em termos da sua bioquímica e fisiologia. Por exemplo, sabe-se pouco ainda sobre os fatores que controlam a formação de um heterofilamento de septinas e como isto está relacionado com a ligação e hidrólise de GTP e a associação com membranas celulares. Além disto, das dezenas de hetero-filamentos de septinas teoricamente possíveis, apenas uma única estrutura cristalográfica foi reportada até os dias de hoje e, mesmo assim, a baixa resolução. Sabe-se menos ainda sobre o papel de septinas em organismos inferiores. A presente proposta de pesquisa está dividida em três sub-projetos que abordam respectivamente aspectos da estrutura, função e relação evolucionária de septinas de diferentes organismos, incluindo o homem, um helminto, um cefalocordado e uma alga. Em termos estruturais procuraremos visualizar diretamente filamentos e protofilamentos usando microscopia eletrônica e resolver estruturas cristalográficas por difração de raios-X e RMN de septinas individuais e seus heterocomplexos, além dos seus domínios isolados na presença de ligantes, tais como GTP, GDP e Mg2+. Os resultados serão complementados por estudos funcionais visando identificar por exemplo, parceiros das septinas em algas verdes e os mecanismos de parálise de Schistosoma mansoni induzido pela inibição de septinas in vivo.