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Item Busca e caracterização de inibidores da enzima DacA de Staphylococcus aureus(2016-10-21) Meneghello, RaphaelRecentemente, uma molécula baseada em nucleotídeos, a adenosina monofosfato dimérica cíclica (c-di-AMP), foi identificada em várias bactérias patogênicas, ganhando rapidamente o status de um sinalizador central no controle de diversos processos bacterianos essenciais, tais como transporte iônico e vigilância a danos no DNA. Em Staphylococcus aureus, por exemplo, o c-di-AMP é essencial para homeostase da parede celular e resistência aos estresses ambientais. A biossíntese de c-di-AMP envolve a condensação de duas moléculas de ATP, catalisadas por enzimas que contenham o domínio DAC (diadenilato ciclase). Especialmente em S. aureus, somente uma ciclase (DacA) é responsável pela síntese desse segundo-mensageiro, através da enzima DacA. Recentemente, nosso grupo determinou a estrutura da DacA de S. aureus, demonstrando a importância do seu estado oligomérico para o mecanismo catalítico. Diferentemente da primeira diadenilato caracterizada, a DisA, uma enzima octamérica, a atividade enzimática da DacA ocorre através do encontro de dois dímeros distintos, formando uma interface cataliticamente competente. Dadas essas características, o foco desse trabalho foi a busca de novos inibidores para a DacA, através de triagens em larga escala (HTS), triagem cristalográfica por fragmentos e docagem molecular. Foram encontrados 30 compostos com atividade inibitória nos ensaios de HTS, 15 compostos derivados de fragmentos da triagem cristalográfica e construída uma biblioteca de 480 compostos docados virtualmente no sítio ativo. Os compostos encontrados na triagem cristalográfica foram caracterizados com respeito ao seu valor de IC50 frente à atividade enzimática. O composto AN-584/43409544 se demonstrou bastante promissor, com valor de IC50 de 54 µM. Ainda, um análogo desse composto foi encontrado na interface dimérica da DacA nos estudos cristalográficos, o que mostra um possível sítio alostérico para o desenvolvimento e busca de inibidores. Os resultados gerados nesse projeto podem servir de base para estudos futuros e desenvolvimento de novos antibióticos, que em combinação com os tratamentos atualmente disponíveis pode levar ao controle das infecções até mesmo das formas mais resistentes de S. aureus.Item Estudo epidemiológico molecular de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) isolados no Brasil e estudo da proteína reguladora de resposta GraR(2016-11-04) Camargo, Ilana Lopes Baratella da CunhaLinhagens multirresistentes e virulentas de MRSA tem se disseminado em hospitais do mundo todo e são poucas as alternativas de tratamento para infecções causadas por este patógeno. Neste estudo, cerca de 150 amostras isoladas de diferentes espécimes clínicos de pacientes infectados ou colonizados hospitalizados em diferentes regiões do Brasil serão analisadas. Estes resultados fornecerão dados importantes para os médicos e enfermeiros quanto à existência ou não de disseminação de alguma linhagem no hospital, o que poderia caracterizar um surto. Para tanto, realizaremos as tipagens moleculares através das técnicas de Gel de Eletroforese em Campo Pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) e Tipagem por Sequenciamento de Multilocus (Multilocus sequence typing, MLST), além de tipar o elemento SCCmec presente nas principais linhagens encontradas. Avaliaremos a eficácia de vários antimicrobianos e a frequência de h-VISA e VISA dentre os MRSA isolados no Brasil. Além disso, verificaremos a prevalência de mutações em genes que estão envolvidos no mecanismo de VISA e a presença dos genes da Leucocidina Panton Valentine. Estudaremos também utilizando técnicas cristalográficas o regulador de resposta GraR da linhagem S. aureus N315 e o mutante GraR* da linhagem S. aureus Mu50, que tem sido descrito como responsável pela diminuição da sensibilidade à vancomicina e outras drogas. Este estudo permitirá conhecermos detalhes da proteína GraR que pode nos fornecer dados importantes para a descoberta do mecanismo de resistência em VISA.