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Item Estudo celular, bioquímico e biofísico da enzima selenofosfato sintetase de Naegleria gruberi(2015-09-21) Bellini, Natalia KarlaO microrganismo alvo deste estudo pertence ao gênero Naegleria, que compreende amebas de vida livre amplamente distribuídas ao redor do mundo. Estas possuem estratégias de adaptação em condições de temperatura e pH que envolvem a diferenciação das células para as formas flagelada e cística. A via de biossíntese e incorporação do aminoácido selenocisteína (Sec, U) em N. gruberi foi descrita e, devido à incorporação co-traducional deste aminoácido em resposta a um códon UGA em fase de leitura, possui diversos fatores específicos que tornam a via alvo de estudos moleculares. Dentre os genes identificados, destaca-se o de selenofosfato sintetase (SPS), uma proteína funcionalmente dimérica envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, essencial à síntese de Sec. Diferindo das SPSs homólogas, em N. gruberi a proteína (NgSPS2) é codificada em fusão N-terminal com uma metiltransferase e totaliza 737 aminoácidos. Esta descoberta motivou os objetivos da pesquisa baseada na investigação celular de NgSPS2 nativa nas três diferentes formas de vida de N. gruberi através de ensaios imunoenzimáticos, e a caracterização bioquímica e biofísica da proteína recombinante. A análise dos resultados obtidos por Western blot indicaram que NgSPS2, in vivo, apresenta os dois domínios metiltransferase e SPS separados após a tradução para uma cultura amebóide e, após alcançar a diferenciação de cada uma das formas isoladamente, este resultado se confirmou também para cistos e flagelados. A investigação de N. gruberi em cultura indica o aumento na atividade da via de síntese de selenoproteínas na presença de selênio conferindo resistência às condições de estresse oxidativo. A caracterização bioquímica do domínio C-terminal de NgSPS2, por cromatografia de exclusão molecular analítica e eletroforese não desnaturante, revelou predominância de dímeros em solução, coerente com SPSs homólogas. Os testes de cristalização não resultaram na obtenção de cristais, porém a proteólise limitada permitiu selecionar tripsina como potencial para a clivagem do N terminal do N terminal flexível. A conservação dos resíduos de aminoácidos funcionais em NgSPS2.CTD e seu comportamento em solução confirmam a obrigatoriedade da união de cada monômero e, por isso o domínio metiltransferase adicional pode ser desfavorável à montagem do dímero e in vivo a fusão é desfeita após a tradução.Item Estudos estruturais e funcionais da Selenofosfato Sintetase de Trypanosoma brucei e Leishmania major(2014-08-04) Faim, Lívia MariaA síntese e incorporação de Selenocisteína em selenoproteínas ocorre co tradicionalmente direcionado pelo códon de terminação UGA. Uma maquinaria única de enzimas e fatores proteicos é necessária para síntese de selenocisteína e decodificação do códon UGA de terminação da tradução para inserção de selenocisteína. Dentre as enzimas envolvidas, está a Selenonofosfato sintetase (SPS2), responsável por catalisar a ativação de seleneto com adenosina 5 trifosfato (ATP) para gerar selenofosfato, o doador de selênio reativo que é substrato da próxima enzima da via para formação de selenocisteína. Estudos recentes identificaram a presença da via de biossíntese de selenocisteína em parasitas kinetoplastidas e subsequentemente a proteína SPS2 de Trypanosoma brucei e Leishmania major foram caracterizadas. Entretanto, trabalhos estruturais e funcionais das enzimas permaneceram não reportados. Dessa forma, este trabalho teve seu foco estabelecido na realização de estudos estruturais e funcionais da SPS2 de T. brucei e L. major. Para caracterização da proteína em solução foram empregadas as técnicas de cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese em gel nativo, espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de Raios X a baixo ângulo (SAXS) e ultracentrifugação analítica (AUC). Os resultados obtidos revelaram uma mistura de dímeros e tetrâmeros em solução para ambas SPS2 com predominância de dímeros. Muitas estratégias de cristalização e melhorias na difração foram utilizadas para obtenção de cristais proteicos apropriados para determinação da estrutura cristalográfica das SPS2. Cristais de SPS2 de T. brucei inteira e SPS2 de L. major com N-terminal truncado foram obtidos. Porém, somente a estrutura cristalográfica da proteína SPS2 de Leishmania major com o N-terminal truncado a 1,9 Å de resolução foi determinada. Estudos comparativos entre esta estrutura e outras selenofosfato sintetases mostrou a mesma organização estrutural entre elas. Experimento de complementação funcional das SPS2 truncadas e mutadas pontualmente revelou três resíduos localizados no N-terminal como fundamentais para atividade da SPS2 (Leu33, Thr34; Tyr36 e Leu37, Thr38; Tyr40 para SPS2 de T. brucei e L.major, respectivamente). Análise mutacional baseada nas estruturas cristalográficas indicou que estes resíduos podem estar envolvidos no mecanismo de entrega do selenofosfato para a próxima enzima da via, a Selenocisteína sintase. Isto poderia evitar a difusão de compostos reativos de selênio, resultando em uma eficiência na síntese de selenocisteína. Os resultados aqui apresentados forneceram informações importantes e novas perspectivas a respeito do mecanismo de catalise da enzima selenofosfato sintetase na via de síntese de selenocisteína.