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Item Estudo dos genes de micro-exon (MEGs) do parasita humano Schistosoma mansoni e seus produtos protéicos(2017-05-29) Marco, Ricardo deEste projeto tem como objetivo estudar genes de micro-exons (MEGs) e seus produtos proteicos que se encontram na interface parasita-hospedeiro. Realizaremos a expressão das principais isoformas de alguns PCMs (proteínas codificadas por micro-exon genes) em sistema heterólogo para caracterização de propriedades biofísicas e ensaios para buscando esclarecer a função destas proteínas. Ensaios de duplo-híbrido serão realizados com o intuito de buscar possíveis interações entre PCMs e proteínas de leucócitos humanos. Além disso, analises bioinformáticas compararão a estrutura da MEGs nos três organismos do gênero Schistosoma com genoma disponíveis, o S. mansoni, S. japonicum e o S. Haematobium, com a finalidade de entender melhor a evolução desta classe de genes.Item Estudo de genes envolvidos na relação parasita-hospedeiro na esquistosomose(2017-05-29) Marco, Ricardo deEste projeto tem como objetivo estudar genes que codificam proteínas que se encontram na interface parasitahospedeiro ou são secretadas. Inicialmente, será realizado um estudo de sequenciamento em larga escala, buscando caracterizar transcritos enriquecidos nos tecidos da superfície do parasita. Para isso, se estabelecerá um protocolo para extração diferencial de RNA e sequenciamento em larga escala de RNA de frações de superfície do parasita adulto, macho e fêmea. Comparação destes dados com os obtidos para vermes inteiros permitirá a determinação de transcritos enriquecidos na superfície do parasita. Paralelamente, será realizado o sequenciamento direcionado dos transcritos gerados a partir de genes de microexons, uma nova classe de genes em Schistosoma mansoni ainda não caracterizada. Estes genes são compostos de exons extremamente curtos e codificam proteínas secretadas. A caracterização preliminar, realizada por nós, indica que esses genes geram uma grande variedade de transcritos por meio de splicing alternativo. Desse modo, serão realizados experimentos de RT-PCR com primers específicos e sequenciamento utilizando RNA de diversos estágios do parasita, com o objetivo de caracterizar a expressão diferencial de formas alternativas desses transcritos ao longo do ciclo de vida do parasita. Depois disso, se realizará a expressão das principais isoformas de algumas PCMs (proteínas codificadas por microexon genes) em sistema heterólogo para caracterização de propriedades biofísicas, ensaios para esclarecer a função destas proteínas, e ensaios de Western blot e imunolocalização para a confirmação da localização dessas proteínas no tegumento do parasita adulto. A implementação deste projeto permitirá o estabelecimento de uma linha de estudo de transcriptomas no Departamento de Física e Informática do IFSC-USP. Essa linha de pesquisa permitirá a descrição de transcritos de interesse no estudo da esquistossomose, cujos produtos proteicos poderão ser futuramente estudados através de colaborações com outros membros do departamento, que possui uma tradição na expressão heteróloga e estudos estruturais de proteínas.Item Estudo das relações quantitativas entre a estrutura e a atividade de inibidores da purina nucleosídeo fosfarilase de Schistosoma mansoni da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase glicossomal de tryponasoma [... ](2017-05-11) Andricopulo, Adriano DefiniOs objetivos principais deste projeto são os estudos das relações quantitativas entre a estrutura e a atividade de inibidores da purina nucleosídeo fosforilase de Schistosoma mansoni, da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal de Trypanosoma cruzi e da adenina-fosforribosil-transferase de leishmania tarentolae, compostos candidatos a protótipos de novos fármacos no tratamento quimioterápico da esquistossomose, doença de Chagas e leishmaniose, respectivamente. Para a realização de nossos objetivos, planeja-se a criação de amplos conjuntos padrões de dados para inibidores das enzimas alvo. Estes conjuntos, contendo os dados de estrutura e atividade inibitória correspondentes, organizados e classificados, serão a base científica para os estudos de modelagem molecular e o desenvolvimento de modelos de QSAR/QSAR 3D, empregando diferentes abordagens e metodologias de QSAR. Os modelos preditivos de QSAR/QSAR 3D, uma vez criados, serão úteis para o planejamento e desenho estrutural de novas moléculas que possuam propriedades farmacoterapêuticas otimizadas, capazes de representarem novas entidades químicas, candidatas a protótipos de novos fármacos na quimioterapia segura das doenças infecto-parasitárias de interesse neste projeto.Item Caracterização estrutural e funcional de duas Nucleosídeo Fosforilases de Schistosoma mansoni(2016-11-17) Souza, Juliana Roberta Torini deAs doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. Causada pelo parasita Schistosoma mansoni a esquistossomose mansônica afeta aproximadamente 259 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. O S. mansoni não possui a via \"de novo\" para a biossíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessas bases, portanto, essa via é um alvo em potencial. Agentes capazes de bloquear a atividade das enzimas participantes desta via atuam de forma inespecífica e são quase sempre tóxicos ao homem e por isso o estudo minucioso das pequenas diferenças encontradas entre as enzimas do hospedeiro e do parasita são de extrema importância. Uma diferença marcante entre a via de salvação de purinas do parasita e do hospedeiro humano é a presença de atividade para adenosina fosforilase, que no parasita é exercida por duas entidades distintas: pela enzima Metiltioadenosina fosforilase de S. mansoni (SmMTAP) e por uma enzima até então desconhecida. A enzima SmMTAP naturalmente converte 5\'-deoxi-5\'-metiltioadenosina (MTA) em adenina livre, mas ao contrário do que é visto no hospedeiro, no parasita essa enzima atua preferencialmente na conversão de adenosina. Substituições encontradas no sítio ativo dessa enzima, podem explicar tamanha preferência pelo substrato alternativo, revelando mecanismos distintos da enzima humana. A enzima Purina nucleosídeo fosforilase de S. mansoni (SmPNP) converte inosina e guanosina à hipoxantina e guanina, respectivamente, mas não possui atividade catalítica para adenosina. No entanto, no genoma de S. mansoni é descrita uma isoforma para a SmPNP (SmPNP2), cuja atividade catalítica é desconhecida e, portanto, essa enzima pode também atuar na conversão de adenosina juntamente com a SmMTAP. Assim, os objetivos deste trabalho foram realizar estudos bioquímicos da ação da enzima SmMTAP e realizar a caracterização estrutural e funcional da enzima SmPNP2. Para isso, foram realizadas mutações no sítio ativo da SmMTAP (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L), as mutantes da SmMTAP juntamente com a enzima SmPNP2 foram clonadas, expressas de forma heteróloga e purificadas. Foram realizados ensaios de cristalização e cinéticos por espectrofotometria utilizando um sistema acoplado. A atividade da SmPNP2 foi ainda avaliada por calorimetria e HPLC. Foram determinadas as constantes catalíticas da forma nativa e para os cinco mutantes da SmMTAP para cinco diferentes substratos. Foi determinada atividade catalítica da SmPNP2 por 3 diferentes substratos: adenosina, inosina e citidina, as constantes catalíticas foram determinadas para os três substratos. Foram obtidos cristais para os mutantes da SmMTAP e da SmPNP2, que foram submetidos à difração de raios X nas linhas I04-1 e I02 do laboratório de radiação síncrotron Diamond Light Source (DLS). Foram resolvidas 9 estruturas dos mutantes da SmMTAP e 4 da proteína SmPNP2. Os dados cinéticos, juntamente com os dados estruturais, permitiram compreender mecanismos catalíticos e de interação das proteínas estudadas, complementando o conhecimento do metabolismo do parasita Schistosoma mansoni e revelando alvos em potencial para o desenvolvimento de fármacos específicos.Item Estudos das enzimas adenosina kinase isoforma 1, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase isoformas 1, 2 e 3, adenilsuccinato liase, adenilsuccinato sintetase de Schistosoma mansoni(2016-11-28) Romanello, LarissaO Schistosoma mansoni, parasita responsável pela esquistossomose (barriga dágua), doença que afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo mundo, não possui a via de síntese de purinas, dependendo integralmente da via de salvação de purinas para seu suprimento dessas bases. Uma vez que a terapia se resume a administração de um único fármaco, o praziquantel, diversos casos de resistência do parasita a esse medicamento foram reportadas, sendo assim esta via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos contra a doença. As enzimas adenosina kinase (AK), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT), adenilsuccinato liase (ADSL) e adenilsuccinato sintetase (ADSS) são enzimas chave desta via. Este trabalho faz parte de um projeto maior que visa a obtenção de todas as estruturas das enzimas envolvidas na via de salvação de purinas de Schistosoma mansoni. O cDNA correspondente às enzimas foi amplificado e clonado no vetor de expressão pOPIN; as enzimas AK isoforma 1, HGPRT isoforma 1 e ADSL foram expressas em E. coli Lemo21(DE3) e HGPRT isoforma 3 em E. coli B834(DE3); purificadas em coluna de cobalto agarose por afinidade, concentradas e cristalizadas no kit de cristalização Morpheus (Molecular Dimensions) no Oxford Protein Production Facility (OPPF) em Harwell UK. As coletas de dados por difração de raio-X foram realizadas no Síncrotron Diamond Light Source (DLS) - UK. Foram coletadas duas estruturas de ADSL, a 2.36Å de resolução em complexo com AMP e 2.14Å na forma Apo. A análise das estruturas revelou uma estrutura tetramérica bastante conservada entre as ADSLs, sendo este estado de oligomerização requerido, uma vez que resíduos de três das quatro subunidades compõem o sítio ativo. Apesar do sítio ativo ser altamente conservado entre SmADSL e ADSL humana, a interface dimérica dessas enzimas tem se apresentado suficientemente distintas, o que pode representar um potencial alvo para o desenvolvimento de um inibidor. O ensaio de atividade enzimática de ADSL revelou uma reação endotérmica, indicando que a contribuição da entropia relacionada a grande quantidade de moléculas de água presentes no sítio ativo é importante para a reação cinética. Após diversos experimentos de otimização dos cristais de HGPRT1 e aproximadamente 200 cristais testados, foi obtida uma estrutura em complexo com IMP a 2.8Å de resolução. A análise da estrutura revelou uma estrutura tetramérica. Apesar das subunidades não compartilharem o sítio ativo, este estado de oligomerização é requerido, uma vez que resíduos que compõem o sítio ativo também estão envolvidos em interações na interface dimérica, orientando o resíduo invariável Arg206 na direção do sítio ativo. Foram identificadas quatro mutações na região do sítio ativo entre SmHGPRT e HGPRT humana: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. Desta forma, a obtenção das estruturas contribui para o entendimento bioquímico desta via essencial para o parasita e de como este pode ser seletivamente privado de recursos.Item Estudo da estrutura e parceiros proteicos de proteínas codificadas por genes de micro-exons de Schistosoma mansoni(2015-07-22) Orcia, DéboraOs genes micro-exons (MEGs) foram recentemente identificados no genoma do Schistosoma mansoni, verme responsável pela esquistossomose, doença que afeta mais de 262 milhões de pessoas em mais de 78 países. Devido à capacidade de produção de proteínas variantes pelo splicing alternativo de MEGs, expressão preferencial em estágios do ciclo de vida em contato com o hospedeiro definitivo e a verificação de que várias proteínas codificadas por estes genes são secretadas para o meio externo ao parasito, acredita-se que estas proteínas possuam um papel importante na interação parasito-hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi estudar e caracterizar a estrutura e dinâmica conformacional das proteínas codificadas por MEG-11 e MEG-14 e verificar a interação da proteína MEG-14 com proteínas humanas. A análise das proteínas MEG-11 e MEG-14 produzidas em sistema recombinante com a técnica de dicroísmo circular (CD) demonstrou que ambas as proteínas apresentavam estruturas secundárias majoritariamente desordenadas quando em solução aquosa. Entretanto, foi verificado que a presença de TFE, a desidratação das proteínas e o aumento de temperatura favoreciam o surgimento de estruturas ordenadas nestas proteínas. Um ganho de estrutura secundária também foi observado para a proteína MEG-14 na presença de vesículas de fosfolipídios e micelas de detergente carregadas negativamente. Estes resultados suportam a identificação destas proteínas como clássicas proteínas intrinsicamente desordenadas (IDPs) e abre a possibilidade de sua interação com diferentes parceiros e fatores a serem relacionados com os papéis multifuncionais e estados dentro do hospedeiro. Resultados prévios de experimentos de duplo-hibrido do nosso grupo apontavam uma possível interação de MEG-14 com a proteína humana S100A9. Através da técnica de pulldown foi possível confirmar uma interação dependente da presença de cálcio entre estas duas proteínas. Análises adicionais da interação MEG-14/S100A9 com as técnicas de ITC e SPR permitiram calcular a constante de dissociação entre as proteínas em aproximadamente 2 μM. Finalmente, experimentos ex vivo permitindo a ingestão da proteína S100A9 acoplada a uma molécula fluorescente pelo S. mansoni resultaram na acumulação da proteína na glândula do esôfago, local onde já foi localizada a proteína MEG-14 em S. japonicum, sugerindo que a interação observada nos experimentos in vitro está ocorrendo com a proteína MEG-14 nativa.Item Caracterização estrutural e funcional de septinas de Schistosoma mansoni(2014-01-07) Zeraik, Ana ElizaSeptinas são proteínas pertencentes à família das GTPases que estão envolvidas em uma variedade de funções celulares. Verificamos através de análises bioinformáticas que Schistosoma mansoni, um dos principais agentes etiológicos da esquistossomose, possui quatro genes que codificam septinas (SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2). O objetivo deste trabalho foi a produção heteróloga das proteínas codificadas por estes genes, visando estudos estruturais e funcionais das mesmas. As septinas SmSEPT5 e SmSEPT10 foram expressas em sistema recombinante e foi possível a obtenção de formas solúveis destas proteínas. Experimentos de gel filtração e cross-linking mostraram que elas são diméricas em solução e estáveis em ampla faixa de pH, embora agregados proteicos tenham sido observados com o aumento da temperatura. Ambas as proteínas foram capazes de ligar GTP e GDP, embora apenas SmSEPT5 tenha apresentado atividade GTPásica. Mg2+ se mostrou essencial para a ligação de GTP a ambas as proteínas, enquanto a ligação do GDP foi independente da presença deste cofator. Ensaios de cristalização com o domínio GTPase de SmSEPT10 resultaram em cristais de ótima qualidade cuja difração resultou na obtenção da estrutura com melhor resolução alcançada até o momento para septinas: 1.9 Å para a forma ligada a GDP e 2.1 Å para a forma ligada a GTP. A análise da sobreposição das estruturas obtidas resultou na observação do deslizamento de uma fita β em relação às demais, que acreditamos estar envolvido com o mecanismo de associação destas proteínas à membranas. Um sistema de coexpressão foi construído em que SmSEPT5, SmSEPT10 e SmSEPT7.2 foram coexpressas e copurificadas, resultando na verificação da formação de hetero-oligômeros e filamentos por estas proteínas. Tratamento de diversas fases do ciclo de vida do parasito com um composto (FCF) que afeta a dinâmica de filamentos de septina, resultou em um fenótipo reversível de paralisia no parasito. Estudos de imunolocalização revelaram a colocalização de septinas e actina em fibras musculares do parasito, sugerindo que a interação entre filamentos de septina e actina pode ter um papel importante nas funções motoras do parasita. A imunolocalização revelou ainda a presença de septinas em placas epiteliais ciliadas de miracídios, células germinativas de miracídios e esporocistos e protonefrídios de cercárias. Os resultados apresentados aqui constituem a primeira descrição de septinas em platelmintos e nos possibilitam o estabelecimento de correlações estruturais e funcionais entre septinas de S. mansoni e complexos análogos de septinas de outros organismos, contribuindo para a elucidação da função desta família de proteínas.Item Caracterização estrutural da Uridina Fosforilase de Schistosoma mansoni(2013-11-01) Silva Neto, Antonio Marinho daA esquistossomose humana, doença causada pelo S. mansoni e com 6 milhões de infectados somente no Brasil, possui uma única estratégia terapêutica eficiente atualmente disponível. Esta se baseia na utilização de praziquantel e relatos de cepas resistentes à essa droga tem despertado o interesse da comunidade científica sobre o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Uma melhor caracterização dos processos metabólicos do parasita podem auxiliar nestas buscas. Diante desse contexto, nosso grupo tem trabalhado na caracterização estrutural e funcional das enzimas que compõem a via de salvação de purinas e pirimidinas deste parasita, com dez enzimas já caracterizadas. Uma das enzimas remanescentes é a uridina fosforilase (UP) (EC 2.4.2.3), cujo a qual o genoma do parasita apresenta duas isoformas, a smUPa e smUPb (92% de identidade entre elas). Com o objetivo de caracterizar estruturalmente estas enzimas, ambas foram obtidas via expressão heteróloga, purificadas e submetidas a ensaios de cristalização e co-cristalização (para obtenção das estruturas interagindo com diferentes ligantes). Após coleta de dados de difração de raio-x, processamento e refinamento adequado foram obtidas seis estruturas da smUPa (smUPaapo, smUPa+Timidina, smUPa+timina, smUPa+uracil, smUPa-5fluorouracil) e duas da smUPb (smUPbapo e smUPb+citrato). A análise das estruturas revela que as duas isoformas apresentam essencialmente a mesma estrutura, no entanto, apesar das poucas divergências em nível de sequência de aminoácidos, existem diferenças significativas entre os sítios ativos. A smUPa apresenta o sítio com as mesmas características de UPs conhecidas, em contrapartida a smUPb apresenta duas mudanças significativas que elimina a capacidade de interagir com a base nitrogenada (Q201L) e a cavidade que acomoda a base nitrogenada (G126D), o que torna as smUPs um caso único de isoformas de UP em um mesmo organismo conhecidas. É plausível que a smUPb não seja capaz de catalisar a fosforólise reversível da uridina, sendo ou um pseudogene ou alguma outra enzima com atividade catalítica diferente da UP. Para a completa caracterização destas enzimas, testes de atividade enzimática serão realizados e deverão auxiliar a determinar a real função da smUPb.Item Determinação estrutural e funcional da enzima 5´-deoxi-5´-metiltioadenosina Fosforilase de Schistosoma mansoni(2012-06-06) Souza, Juliana Roberta Torini deAs doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. A esquistossomose mansoni também conhecida como barriga d´água ou doença do caramujo é uma doença parasitária crônica que afeta aproximadamente 207 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. Os medicamentos disponíveis no mercado causam graves efeitos colaterais. Além disso, há relatos de cepas de S. mansoni resistentes à esses medicamentos, justificando assim a busca por novos fármacos. O Schistosoma mansoni não possui a via de novo para a biosíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessa. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar as constantes catalíticas e a estrutura tridimensional da MTAP (EC 2.4.2.28), enzima esta que participam da via de salvação de purinas, e é desta forma essencial para a reprodução do parasita. Esta enzima foi expressa de forma heteróloga, purificada e cristalizada. A proteína foi submetida à ensaios cinéticos em sistema acoplado, onde foram determinadas as constantes catalíticas. A proteína foi também cristalizada em condições que continham 100 mM de Bis-tris ou MES com pH variando entre 6,1 a 6,5 e PEG3350, cuja concentração variou ente 14-18%. Os cristais foram submetidos à difração de raios-X no LNLS e no DLS. Foram obtidos, quatro conjuntos de dados, que foram processados, refinados e analisados. Obteve-se estrutura apoenzima em complexo com fosfato, em complexo com adenina e sulfato, em complexo com tubercidina e sulfato e em complexo com adenina e glicerol em um grupo espacial diferente dos demais. Através da estrutura secundária, foi possível analisar o sítio ativo, além de obter informações preliminares do mecanismo catalítico da enzima alvo. Este trabalho colabora para a futura elucidação completa da via de salvação de purinas em S. mansoni, e fornece informações básicas para que a busca por novos fármacos tenha novos ramos a serem explorados.Item Adenina fosforibosiltransferase de Schistosoma mansoni: proposta de detalhamento do mecanismo catalítico por dinâmica molecular(2011-10-21) Caldas, Victor Emanoel ArminiA Adenina Fosforibosiltransferase (APRT E.C. 2.4.2.7) pertence à família de enzimas Fosforibosil Transferases (PRTase) do Tipo I , que catalisa a conversão reversível de Adenina e 5-fosfo-α-D-ribose-1-difosfato (PRPP) em difosfato e adenosina monofosfato, um importante precursor energético da célula. A APRT integra a via de salvação de purinas, única forma de suprir o balanço de purinas em Schistosoma mansoni. Este trabalho apresenta o isolamento, clonagem, expressão heteróloga e purificação da APRT de S. mansoni a fim de caracterizá-la quanto seus parâmetros físico-químicos. Não se obtendo cristais de proteína, foram elaborados modelos tridimensionais por homologia para estudos de dinâmica molecular e avaliação conformacional via tCONCOORD. A estrutura de APRT humana foi usada como controle nas simulações. Os dados computacionais e de biologia molecular foram comparados entre si para validação mútua e, verificou-se que a análise cuidadosa de dados computacionais é capaz de fornecer informações críticas sobre a APRT, auxiliando e guiando os estudos experimentais. Ainda, as simulações de dinâmica molecular foram capazes de evidenciar a abertura de loops do sítio ativo, explicitar a importância da análise de rotâmeros em modelos, permitindo, então, rearranjar da forma correta resíduos erroneamente modelados. Por fim, um estudo envolvendo mecanismo catalítico sugere a participação de uma molécula de água abstraindo o próton ligado ao N9 da adenina e, para efeito de comparação, um mecanismo alternativo independente desta participação também foi descrito. Ambas as observações expandem a corrente visão sobre o mecanismo catalítico de APRTs.