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Item Caracterização molecular e estrutural do Leishmania RNA vírus LRV1-4(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueAlém do inegável impacto em saúde humana e de animais domésticos, o estudo dos protozoários (Reino Protista) é de grande relevância pela diversidade de espécies, muitas ainda desconhecidas, e sua importância evolutiva no surgimento de eucariotos. Desta forma, o estudo de diversos aspectos da biologia de protozoários, parasitas ou não, se justifica. O Leishmania RNA vírus 1-4 (LRV1-4) é um vírus classificado como pertencente a família Totiviridae. Possui capsídeo icosaédrico de genoma composto por RNA de dupla fita (dsRNA) que codifica duas proteínas, uma capsidial e uma RNA polimerase. Sendo pouco estudado, mas com indicação de ter relevancia na invasão celular de Leishmania, iniciamos a caracterização molecular deste vírus com o objetivo de empreender estudos estruturais e funcionais. Dados recentes indicam o envolvimento do LRV1-4 na patogênese de Leishmania no hospedeiro humano, tornando seu estudo de fundamental importância para o entendimento dessa doença e de seu papel na relação parasito-hospedeiro. Trabalhos recentes desenvolvidos por nosso laboratório resultaram no estabelecimento de uma metodologia de purificação de partículas de LRV1-4 com o qual obtivemos imagens inéditas de Microscopia Eletrônica de Varredura do capsideo. Na presente proposta, com base nos procedimentos já estabelecidos, daremos continuidade aos estudos de Microscopia Eletrônica de Varredura por Negative Staining e Crio-Microscopia Eletrônica, caracterização molecular e estrutural do capsideo viral extraído de células infectadas de Leishmania guyanensis e de caspideos recombinantes expressos em Leishmania tarentolae. Os estudos aqui propostos deverão permitir a construção de um modelo estrutural do capsídeo do LRV1-4 e contribuir no entendimento do processo de replicação, a confirmação (ou não) dentre os Totiviridae e o seu papel na relação parasito-hospedeiro. Além das contribuições ao conhecimento da biologia/patogenia do LRV1-4 este estudo representa a primeira caracterização estrutural de um capsideo viral realizada no Brasil e assim um avanço importante para a área de virologia e biologia estrutural no pais.Item Preparação bioquímica para caracterização molecular e estrutural do RNA vírus LRV1-4(2015-05-15) Azevedo, Érika Chang deO vírus de Leishmania 1-4 ( do inglês Leishmania RNA virus 1-4 ou LRV1-4) é um vírus da família Totiviridae, e que possui capsídeo icosaédrico e RNA dupla-fita que codifica duas proteínas (proteína capsidial e RNA polimerase). Dados recentes indicam o envolvimento do LRV1-4 na patogênese de Leishmania no hospedeiro humano, tornando seu estudo de fundamental importância para o entendimento dessa doença e de seu papel na relação parasito-hospedeiro. Há relatos sobre a purificação do vírus a partir do seu hospedeiro natural (Leishmania guyanensis) e a partir de sistemas de expressão heteróloga. Este trabalho tem por objetivo estabelecer os métodos de purificação para posteriores estudos estruturais por Microscopia Eletrônica de Transmissão por Contraste Negativo (NS-TEM) e por Crio-Microscopia Eletrônica (Cryo-EM). Os estudos aqui propostos irão permitir a construção de um modelo estrutural do capsídeo do LRV1-4 e sua identificação correta dentre os totivírus. Além das contribuições ao conhecimento da biologia/patogenia do LRV1-4 este estudo representa a primeira caracterização estrutural de um capsídeo viral realizada no Brasil, e assim um avanço importante para a área de virologia e biologia estrutural no pais. Foram realizadas ultracentrifugações biológicas, utilizando gradientes de sacarose, para a purificação do vírus a partir do extrato celular de L. guyanensis. As frações que apresentaram RNA viral foram analisadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (Campinas LNNano CNPEM). Além disso, foram realizadas tentativas de expressar a proteína do capsídeo (ORF2) em Leishmania tarentolae e Escherichia coli. Foram também realizados esforços para a obtenção de anticorpos a partir de peptídeos sintetizados após análise computacional da sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo. As amostras obtidas a partir do hospedeiro natural do vírus se apresentaram heterogêneas quando analisadas por NS-TEM, de modo que não foi possível a realização de uma análise estrutural. Porém, a presença de partículas do tamanho esperado para o vírus em amostras em que foi detectado o RNA viral indicam que são necessários esforços para obtenção de uma amostra de maior pureza e homogênea. Além disso, não foi possível obter a proteína do capsídeo nos sistemas de expressão heteróloga. A presença de 25 resíduos de cisteína pode estar levando a proteína à degradação rápida em bactéria. Os experimentos de expressão em células de Leishmania ainda não foram conclusivos. Foi obtido um anticorpo anti-peptídeo que reconhece a proteína do capsídeo, tornando possíveis experimentos como imunolocalização e imunoprecipitação do vírus.