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Item Mecanismos de interação molecular de polieletrólitos antimicrobianos em membranas modelo por espectroscopia vibracional não linear(2015-10-13) Rimoli, Caio VazPesquisa em novas moléculas e estratégias antimicrobianas é crucial devido ao aumento de resistência a antibióticos pelos microrganismos. Polímeros antimicrobianos tem várias vantagens quando comparados a outros biocidas pequenos: maiores tempo de vida, potência, especificidade e baixa toxicidade residual. Logo, outras aplicações tecnológicas como recobrimentos, embalagens ou produtos têxteis antimicrobianos poderem ser exploradas. Em particular, derivados hidrossolúveis de quitosana, como os oligômeros de quitosana (OQ), são biopolímeros catiônicos extraídos de fontes renováveis que são candidatos promissores a serem agentes antimicrobianos de amplo espectro (fungos, bactérias gram-positivas e bactérias gram-negativas). Diferentemente da quitosana, que é sobretudo bioativa em pHs ácidos, OQ permanece catiônico – e portanto ativo – em pH fisiológico. Não obstante, o mecanismo exato pelo qual o polímero age nas membranas celulares permanece desconhecido em nível molecular. Este trabalho visa investigar o mecanismo de interação entre os OQ e modelos de membrana biomiméticos (Filmes de Langmuir). Para comparação, outro polieletrólito catiônico sintético com propriedades antibacterianas, o PAH – poli(hidrocloreto de alilamina) – foi investigado. Nós realizamos a Espectroscopia por Geração de Soma de Frequência (SFG) em Filmes de Langmuir de fosfolipídeos em água pura e em subfases contendo antimicrobianos. A Espectroscopia SFG nos permite obter o espectro vibracional de moléculas interfaciais (filme lipídico e moléculas que estão interagindo com ele: água e antimicrobianos) sem nenhuma contribuição de moléculas do interior do volume e é muito sensível às conformações lipídicas da membrana. Um fosfolipídeo zwitteriônico (DPPC) foi usado para modelar membranas tipo-humana, enquanto outro carregado negativamente (DPPG) modelava a tipo-bacteriana. Isotermas em subfases contendo antimicrobianos mostraram que ambos PAH e OQ causam uma pequena expansão das monocamadas de DPPC. Entretanto, para as monocamadas de DPPG ambos os polieletrólitos geraram uma expansão significativa. Entre eles, os OQ causaram um efeito mais drástico. Espectros SFG dos estiramentos CH mostraram que a conformação lipídica permaneceu bem empacotada em todos os casos (ligeiramente menos ordenada com PAH) apesar das expansões da membrana. Isto indica que os OQ foram inseridos formaram ilhas de OQ dentro do filme lipídico. Mudanças na forma de linha dos estiramentos da água interfacial indicaram que a adsorção de PAH em ambos os filmes foram capazes de compensar as cargas negativas, gerando uma inversão de cargas na superfície. Os espectros SFG dos grupos fosfato também indicaram que, em água pura, as cabeças polares de DPPC estão com uma orientação mais ordenada do que no caso do DPPG. Contudo, quando interagindo com os polieletrólitos catiônicos, as cabeças dos DPPGs se ordenam, ficando preferencialmente perpendicular à interface. Experimentos com antimicrobianos injetados na subfase enquanto os filmes de Langmuir já estavam condensados indicaram que os OQ foram capazes de penetrar na monocamada, embora causando uma expansão no filme menor. Esta comparação evidencia que a escolha da metodologia experimental afeta o resultado, mas ambas podem ser complementares, visto que podem representar diferentes fases do ciclo celular das biomembranas. A visão detalhada provida aqui para as interações moleculares desses polieletrólitos com filmes lipídicos podem os elucidar mecanismos de atividade biocida deles e auxiliar no planejamento racional de novos polímeros antimicrobianos.Item Filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett de polianilina processada com ácidos funcionalizados(2013-11-18) Riul Júnior, AntonioFilmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett (LB) foram produzidos a partir da polianilina não substituída, que se tornou processável e solúvel em clorofórmio apos ser dopada com ácidos funcionalizados. Para atingir condições otimizadas de formação e deposição dos filmes, foi realizado um estudo criterioso empregando vários ácidos funcionalizados: canfor sulfônico (CSA), dodecilbenzeno sulfônico (DBSA) e tolueno sulfônico (TSA); e também os solventes e plastificantes N-metilpirrolidinona (NMP) e m-cresol. Soluções de polianilina de alta massa molar processada com estes ácidos foram depositadas sobre subfases aquosas ácidas (pH = 2), formando os chamados filmes monomoleculares de Langmuir. Através de um estudo dos parâmetros que influenciam a formação dos filmes de Langmuir conseguimos obter monocamadas estáveis. Desta forma os filmes puderam ser transferidos para substratos sólidos (vidro bk7), usando a técnica de Langmuir-Blodgett. Os filmes LB produzidos são do tipo Z, ou seja, a deposição só é bem sucedida na retirada do substrato, o que significa que mesmo no filme de Langmuir alguns grupos hidrofílicos se encontravam na interface filme/ar. Os filmes LB foram caracterizados por espectroscopia de UV-vis., medidas de condutividade usando o método de quatro pontas, voltametria cíclica e medidas do potencial de superfície. Os filmes LB apresentam propriedades óticas e eletroativas semelhantes as dos filmes de polianilina fabricados por centrifugação. A absorbância da banda polarônica aumenta linearmente com o número de camadas depositadas, o que demonstra que cada camada contribui com a mesma quantidade de material para o filme. A condutividade dos filmes e da ordem de 10-4 S/cm, inferior aos valores medidos para filmes obtidos por centrifugação de soluções de polianilina com CSA e DBSA, mas é maior do que a de alguns outros filmes LB de polianilina relatados na literaturaItem Interação de moléculas biologicamente ativas com filmes de Langmuir de fosfolipídios(2013-11-11) Sánchez, Mirna Inés MosqueraA interação de várias substancias bioativas com monocamadas de fosfolipídios foi investigada usando isotermas de pressão e potencial de superfície, incluindo as drogas farmacológicas dipiridamol (DIP), clopromazina (CPZ) e trifluoperazina (TFP), além da melatonina (MEL) e o colesterol (COL). Os fosfolipídios empregados foram o zwiteriônico dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) e o aniônico dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) espalhados na superfície de água ultrapura, sendo que as monocamadas servem como modelo simples de membranas. A cooperatividade na interação entre fosfolipídios e moléculas com atividade biológica foi essencial para entender os acentuados efeitos na expansão (ou condensação) das monocamadas e as mudanças no momento de dipolo (até 10% de aumento na expansão em relação à monocamada do fosfolipídio puro para as misturas DIP/DPPC) que ocorreram a concentrações molares muito baixas entre 0,2-0,4% do DIP. Tais efeitos foram observados para todas as cinco substâncias investigadas, em todos os regimes de pressão. Nas altas concentrações, o comportamento da interação depende do tipo de mólecula e também de se a monocamada é de DPPC ou DPPG. Para o DPPC, as drogas farmacológicas foram expelidas da interface em vários graus a altas pressões, e existia um máximo de concentração da droga acima do qual ocorria a saturação, provavelmente porque as moléculas em excesso foram para a subfase. Essas concentrações críticas foram de 2% em mol para o DIP e a CPZ e de 5% em mol para a TFP. Para o DIP, em particular, os resultados das isotermas foram correlacionados com experimentos de espectroscopia de FTIR e microscopia de fluorescência \"in situ\", realizados por colaboradores, os quais permitiram a determinação de uma localização precisa da droga estudada. Não existe inserção do DIP na região da cauda hidrofóbica da monocamada do DPPC, com a interação ocorrendo com o grupo fosfato no zwiteríon, cujas pequenas mudanças na orientação induzidas pelo DIP levam a grandes mudanças no momento de dipolo. Como o DPPG está carregado negativamente sobre a superfície da água pura, não existe saturação nos efeitos de expansão com o aumento da concentração das drogas. O aumento do momento de dipolo efetivo na monocamada mista é atribuído a alterações na densidade de carga superficial pela adsorção da droga catiônica, que reduz a contribuição negativa do potencial da dupla camada, quando comparado com o da monocamada de DPPG puro. Os resultados do COL e a MEL devem ser considerados separadamente devido a sua natureza distinta, embora um comportamento cooperativo também tenha observado com grandes efeitos nas baixas concentrações. Tanto o COL como o MEL induzem mudanças na expansão das monocamadas de DPPC até a máxima concentração empregada, 20% molar. Para o COL foi observado um efeito de condensação a baixas concentrações, o qual foi seguido por uma expansão a altas concentrações, confirmando assim resultados prévios da literatura. Todas as monocamadas mistas COL/DPPG apresentavam-se expandidas, também confirmando alguns resultados da literatura para lipídios (diferentes do DPPC) quando misturados com o COL. A interação da MEL com o DPPC foi essencialmente similar à do COL, apesar do fato de a MEL pura não formar monocamadas estáveis. Sua interação com o DPPG foi peculiar já que o efeito que esta induz satura a 5% em mol. Isto também difere do comportamento das drogas farmacológicas. A MEL é neutra em todos os pHs, portanto, sua intenção com as membranas modelo de DPPG e DPPC só pode ocorrer via dipolo. O mesmo se aplica ao colesterol, o que justifica as diferenças no comportameto destas duas moléculas quando comparadas com as drogas (DIP, CPZ, TFP), que são carregadas sobre a água pura, nas misturas com os dois fosfolipídios (DPPG e DPPC).Item Potencial de superfície de filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett.(2009-05-20) Cruz, Cláudia Bonardi Kniphoff daResultados antigos de potencial de superfície de filmes de Langmuir não eram reprodutíveis, devido B presença de impurezas na subfase aquosa sobre a qual os filmes se formavam. Dados recentes para o ácido esteárico, no entanto, mostram um comportamento reprodutível Neste trabalho, foi promovida com sucesso uma recaracterização através de medidas de pressão de superfície (II) e potencial de superfície (ΔV) de compostos alifáticos simples (álcoois, ésteres, ácido e amina), obtidos sobre subfases devidamente purificadas. Os resultados obtidos são inéditos e mostram que o potencial de superfície desses filmes é nulo para grandes valores de área molecular média (A), aumentando a partir de um valor de área crítico, Acr, até atingir um valor máximo, ΔVmax. Modelos para o potencial de superfície de filmes de Langmuir mostram boa concordância com os resultados obtidos. As curvas de pressão e potencial de superfície para os álcoois e ésteres praticamente não se modificam pela alteração do pH da subfase na faixa de 1 a 13. Porém para a amina e ácido há grandes alterações, principalmente nas curvas de potencial de superfície, em virtude da contribuição da dupla camada elétrica. Foram produzidos, também, filmes de Langmuir-Blodgett (LB) a partir de monocamadas de ácido esteárico que foram caracterizados através de medidas de potencial de superfície, com o objetivo de comprovar a importância da contribuição dipolar para o potencial desses filmes. Os resultados indicam que além da contribuição dipolar, há uma contribuição negativa (em tomo de -200 mV) da interface substrato/filme. O potencial de superfície se confirma como uma técnica de caracterização bastante sensível, tanto para filmes de Langmuir como para filmes LB.Item Potencial de superfície e condutância em filmes de Langmuir(2013-11-18) Cavalli, AiltonFilmes de Langmuir de fosfolipídios e ácidos graxos foram caracterizados através de medidas de pressão e potencial de superfície e condutância lateral. O objetivo principal foi o de se fazer um estudo crítico de artigos apresentados na literatura, os quais trazem interpretações errôneas para resultados do potencial de superfície, sugerem a heterogeneidade dos filmes, ou a inexistência do aumento da condutância devido a compressão de um filme de Langmuir. Comprovamos, inicialmente, a homogeneidade macroscópica dos filmes de ácidos graxos e fosfolipídios, medindo-se o potencial com a prova de Kelvin em três posições diferentes. Nenhuma alteração significativa foi registrada. O potencial e a pressão de superfície são nulos para grandes áreas por molécula, sendo que o potencial só se torna não nulo após um aumento abrupto, que ocorre a uma certa área critica. Estes resultados, juntamente com a ausência de histerese nas medidas de pressão e potencial de superfície nos ciclos de compressão-expansão, denotam a inexistência de agregados de dimensões macroscópicas. Eles contradizem, entretanto, a asserção de alguns pesquisadores na ultima conferencia de filmes Langmuir-Blodgett, de que a presença de domínios microscópicos nos filmes de Langmuir deveria afetar os resultados do potencial de superfície. Podemos concluir, portanto, que quaisquer irreprodutibilidades do potencial de superfície para grandes áreas por molécula devem ser atribuídas a impurezas do sistema de medidas, principalmente da subfase. As medidas de condutância foram realizadas diretamente, medindo-se a corrente entre dois eletrodos de platina parcialmente imersos na subfase. Para grandes áreas por molécula, a condutância medida é devido a condutividade de volume da água ultrapura, mas quando o filme e comprimido para áreas menores do que uma certa área critica (a mesma na qual e observado o aumento abrupto do potencial), a condutância sobe ate a pressão de superfície começar a subir, atingindo valores da ordem de 10-8s acima da condutância da subfase. Foram realizadas medidas para um fosfolipídio e um fosfato. Com isso, corroboramos os resultados de condutância, da mesma ordem de grandeza, obtidos em Bangor, no Reino Unido, ao mesmo tempo que são refutadas as observações feitas por grupos de pesquisa dos Estados Unidos e da Rússia. As possíveis causas para a não observação da condutância por esses últimos grupos podem ser o efeito do menisco - queda da área imersa dos eletrodos quando do aumento da pressão de superfície - que mascara o aumento da condutância, ou artefatos experimentais, tais como impurezas na subfaseItem Espectroscopia e microscopia vibracional de filmes de Langmuir através de geração de soma de frequência (SFG)(2015-09-14) Miranda, Paulo BarbeitasDo ponto de vista científico e tecnológico, é de grande interesse obter imagens de uma interface e poder discriminar regiões quimicamente distintas. Dentre as diversas técnicas disponíveis para microscopia de superfícies, todas apresentam aplicabilidade limitada ou não conseguem discriminar contribuições da interface daquela proveniente do volume do material. Esse projeto visa aplicar a espectroscopia vibracional de interfaces por geração de soma de freqüências (“sum-frequency generation” – SFG) ao estudo da estrutura e interação entre lipídios e outras moléculas orgânicas em filmes de Langmuir. Como exemplo, serão estudados filmes de Langmuir de aminas anfifílicas, com os objetivos de determinar o grau de ionização das aminas em função do pH e força iônica da subfase, e de entender como a água interage com a monocamada com diferentes graus de ionização. Pretende-se também montar um aparato para realizar microscopia SFG em interfaces. Essa técnica é uma extensão da espectroscopia SFG e permite obter imagens com sensibilidade intrínseca a interfaces, tem resolução espacial menor que 1 microm, é capaz de detectar submonocamadas orgânicas e de discriminar regiões quimicamente distintas através do seu espectro vibracional. É, portanto, uma técnica muito poderosa e de grande aplicabilidade. Planeja-se então aplicá-la a sistemas onde a utilização de outras microscopias seja impossível, como, por exemplo, na superfície de soluções de pequenas moléculas orgânicas e em filmes de Langmuir contendo misturas de dois componentes muito semelhantes, como ácidos graxos e álcoois de cadeia longa. Esses estudos são essenciais para se obter informações a nível molecular sobre filmes de Langmuir e como eles interagem com a subfase.Item Filmes de Langmuir e automontados de moléculas de interesse biológico(2015-07-13) Oliveira Junior, Osvaldo Novais deEste projeto visa a dar continuidade aos trabalhos em filmes nanoestruturados no Grupo de Polímeros Bernhard Gross, do Instituto de Física de São Carlos, com ênfase em dois problemas científicos: i) novas arquiteturas de filmes nanoestruturados com biomoléculas para fabricar biossensores cujo desempenho será otimizado com técnicas de visualização de informação; ii) uso de filmes de Langmuir como modelo de membrana celular para estudar a interação com moléculas de interesse biológico. No primeiro item serão produzidos filmes automontados contendo enzimas, tais como colesterol oxidase, monoamina oxidase e lipase, que podem ser incorporadas em lipossomos de fosfolipídios visando à sinergia entre esses materiais para detectar diferentes analitos. Os princípios de detecção a serem empregados são impedância elétrica e técnicas eletroquímicas, sendo os dados tratados com métodos de visualização de informação. A optimização das condições de fabricação dos filmes e a caracterização das nanoestruturas serão realizadas com várias técnicas, incluindo espectroscopias de fluorescência, dicroísmo circular e de absorção da região do UV-visível, além de microscopia de força atômica (AFM). No segundo tópico, filmes de Langmuir e Langmuir-Blodgett (LB) de fosfolipídios serão usados para mimetizar a membrana celular, e estudar sua interação com quitosanas e proteínas, como a mucina e a lipase. O problema científico central é verificar como as interações no nível molecular das quitosanas se correlacionam com suas ações fisiológicas. Uma hipótese a ser testada é que a mucoadesão da quitosana é afetada por sua interação com a mucina, que estaria por trás da provável ação da quitosana na redução de peso em seres vivos. Será investigado também o mecanismo de como a quitosana pode afetar a ação da lípase. As interações no nível molecular serão estudadas com técnicas de pressão de superfície, potencial de superfície, microscopia no ângulo de Brewster, espectroscopia no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS) e microscopia de força atômica.Item Uso de técnicas espectroscópicas para o estudo de interações moleculares em filmes de Langmuir, LB e automontados(2015-07-13) Oliveira Junior, Osvaldo Novais deO controle em nível molecular proporcionado pelas técnicas de fabricação de filmes de Langmuir-Blodgett (LB) e automontagem por adsorção física permite o estudo e projeto de novos materiais, para uma variedade de aplicações. Um requisito essencial para a compreensão dessas propriedades é analisar as interações intra- e intermoleculares nos filmes, algo que pode ser hoje realizado com técnicas espectroscópicas, como a espectroscopia de geração de somas de freqüências (sum-frequency generation, SFG), a espectroscopia FTIR tradicional e a espectroscopia no infravermelho de reflexão e absorção com modulação da polarização (polarization-modulation infrared reflection absorption spectroscopy, PM-IRRAS). As duas primeiras já estão disponíveis no Grupo de Polímeros do IFSC-USP, mas a terceira ainda não foi instalada no Brasil. Nossa rede de colaboradores, entretanto, já obteve resultados importantes com a técnica, empregando um equipamento da indústria finlandesa que agora é solicitado no projeto. O objetivo geral é investigar interações intra e intermoleculares em filmes contendo diversos tipos de materiais, desde biomoléculas, polissacarídeos, fosfolipídios, até polímeros sintéticos. As várias questões científicas a serem abordadas incluem o estudo da organização e estruturação de moléculas adsorvidas, a importância da estruturação da água em interfaces, e a correlação entre propriedades físico-químicas de biomoléculas em superfícies e as suas funções biológicas. Como é solicitado um equipamento relativamente caro e sofisticado, o projeto será realizado por uma equipe multiinstitucional, que já colabora há anos.