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Item Estudos estruturais de proteínas associadas à infecção por Enterococcus faecalis(2017-05-15) Reboredo, Eduardo HorjalesEnterococcus faecalis é um agente patogênico associado a infecções hospitalares nas Américas e Europa. ElrA é um fator de virulência associada à invasão celular, uma vez que a supressão do gene elrA reduz a virulência em um modelo de peritonite em camundongos. ElrA tem expressão regulada positivamente por ElrR. ElrR é considerada pertencente à família Rgg de reguladores transcricionais. As proteínas dessa família possuem um domínio hélice-volta-helice (de ligação específica ao DNA) na região N-terminal e um domínio C-terminal rico em alfa-hélices, provavelmente responsáveis pelas mudanças conformacionais associadas à atividade biológica.Iniciamos em 2012 uma colaboração com a Dra. Ilana L. B. C. Camargo (IFSC/USP) e a Dra. Pascale Serror (Unité des Bactéries Lactiques et Pathogènes Opportunistes UR13888, INRA, Jouy-en-Josas, France) em que recebemos o apoio econômico para viagens da USP/COFECUB (Comité Français d'Evaluation de la Coopéracion Universiaire et Scientifique avec le Brasil). Nosso laboratório assumiu como objetivo a determinação da estrutura cristalográfica de duas proteínas que participam no processo de infecção de Enterococcus faecalis: a ElrA que é homóloga das internalinas de Listeria monocytogenes e seu regulador transcricional, ElrR. Obtivemos cristais e primeiros dados de difração de ElrR (um cristal com grupo espacial P41212 ou P43212 a 3.3 Å de resolução e outro cristal de grupo espacial P1 a 2.7 Å). Planejamos resolver a estrutura usando dispersão anômala simples na proteína com seleniometioninas (SeMet SAD) ou substituição isomórfica e dispersão anômala. Os estudos cristalográficos que conduzam à determinação da estrutura tridimensional dessas proteínas têm um duplo objetivo: 1) Por um lado, ajudará na compreensão profunda da função biológica dessas proteínas e de suas participações no processo de infecção; 2) Por outro lado, como alvo em médio prazo, será decisiva na elaboração de uma estratégia de inibição da infecção, através do planejamento de inibidores específicos, que não inibam as moléculas homólogas do hospedeiro, se estas existissem. Planejamos também desenvolver simulações computacionais de Reguladores Transcricionais usando Dinâmica Molecular e Modos Normais, com o objetivo de estudar a relação entre flexibilidade estrutural e ativação alostérica em particular de ElrR. Os sistemas alostéricos, possuse estas existissem em mais de um estado de equilíbrio. Nesse sentido, uma proteína alostérica (como por ex. os reguladores transcricionais homodiméricos) passa por modificações de sua atividade biológica quando está em interação com um ligante alostérico, estabelecendo uma mudança concertada no equilíbrio populacional. Experimentos de RMN determinando tempos de relaxação, já demonstraram que só uma fração dos estados acessíveis a uma enzima, são realmente catalíticos. Métodos de simulação, como dinâmica molecular ou análise de modos normais, geralmente proporcionam uma descrição mais detalhada, por mostrarem o processo em função do tempo e não só os estados de equilíbrio (médias temporais). Procurando apenas por movimentos amplos e de baixa frequência, que são os que têm interesse biológico em relação à transformação alostérica, esperamos identificar regiões da proteína que se comportem como corpos quase rígidos. A caracterização e análises bem sucedidas dessas oscilações de baixa frequência devem ajudar a esclarecer que propriedades dinâmicas que uma proteína necessita para efetuar determinada função. Controlar essas propriedades constituiria uma ferramenta para controlar a regulação da atividade enzimática.Item Comparação genotípica e fenotípica de Enterococcus faecalis resistentes à vancomicina isolados nos anos de 2009 e 2011 em um hospital de Minas Gerais(2014-01-07) Merlo, Thaís PanhanEnterococcus são cocos gram-positivos que ocorrem isolados, aos pares (diplococos) ou em cadeias e pertencem à microbiota intestinal de uma grande variedade de hospedeiros, de mamíferos a insetos. Enterococcus foram originalmente considerados organismos de pouca importância clínica, mas têm se revelado importantes patógenos nosocomiais. O fato dos Enterococcus possuírem formas de resistência intrínseca e adquirida a vários antibióticos dificulta o tratamento de infecções causadas por eles. Enterococcus faecalis é geralmente a espécie predominante entre os enterococos isolados, sendo de 80% a 90% das amostras clínicas. O surgimento de Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE- do inglês vancomycin resistant enterococci) reduziu significativamente as opções de tratamento. O objetivo deste estudo foi identificar e comparar amostras de E. faecalis resistentes à vancomicina (VREfs) isolados em pacientes nos anos de 2009 e 2011, durante um programa de vigilância no Hospital Risoleta Tolentino Neves, em Belo Horizonte, MG. A identificação das espécies foi feita por multiplex-PCR com primers espécie-específicos e os E. faecalis foram selecionados para estudo. Foram realizadas a pesquisa da presença dos genes elrA, cylLL, esp e gelE, a determinação do genótipo responsável pela resistência e a caracterização do transposon que contém o gene de resistência, todos por meio de PCR. Foi também realizada a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de acordo com o CLSI (2013) para vancomicina, linezolida, tigeciclina e daptomicina e testes para resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Por fim, a tipagem das amostras foi feita através de eletroforese em campo pulsado (PFGE- do inglês Pulsed Field Gel Eletroforesis) e MLST (Multilocus sequence typing). Foi encontrado que 22,2% dos VRE isolados em 2009 e 61,7% dos isolados em 2011 pertencem à espécie E. faecalis e estes foram utilizados no estudo. Houve surgimento de resistência à tigeciclina nos isolados de 2011, sendo 10 isolados resistentes, logo após o início do uso deste antimicrobiano no hospital. Foi encontrado um isolado de 2011 com resistência intermediária à linezolida. Todos os isolados foram sensíveis à daptomicina e altamente resistentes à vancomicina, com CIM maior que 256 μg/mL. Essa alta resistência à vancomicina é condizente com o genótipo Vana, encontrado em todas as amostras. O perfil de virulência prevalente nos VREfs em 2009 era elrA+gelE+, sendo dos pulsotipos A1 e A4 e ST103. Apenas um isolado de 2009, com pulsotipo A1 apresentou o perfil de virulência cyl+elrA+gelE+. Em 2011, o perfil de virulência prevalente foi cyl+esp+elrA+gelE+, sendo que os 12 isolados com esse perfil pertenciam aos pulsotipos B e C e ST6, que ocorreram somente em isolados de 2011. Onze amostras de 2011 apresentaram o perfil elrA+gelE+ e foram classificadas no pulsotipo A e seis amostras tem perfil cyl+elrA+gelE+ e são dos pulsotipos B e D. Resultados de PFGE mostram a inserção no hospital da linhagem ST6, um clone multirresistente amplamente disseminado em hospitais da Itália, Portugal, Espanha e Estados Unidos. Concluiu-se que houve mudanças no perfil de E. faecalis resistentes à vancomicina no hospital, ao longo dos dois anos, com aumento de resistência e linhagens mais virulentas, sendo estes motivos de preocupação.