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Resultados da Pesquisa
Item The sugarcane EST project(2017-05-29) Thiemann, Otavio HenriqueA cultura da cana-de-açúcar representa uma importante parcela da atividade agroindustrial do país bem como do estado de São Paulo. Sua importância econômica é significativa, sendo a cana essencial na produção açucareira e do álcool e também na composição de forragem animal. As espécies atualmente cultivadas são o resultado de diversos cruzamentos interespecíficos e da manipulação humana. Resulta disso um genótipo complexo que torna o mapeamento dos caracteres desejáveis para o melhoramento genético uma tarefa difícil. O sequenciamento de ESTs (Expression Sequence Tags) de diferentes órgãos vegetais se mostra como uma via apropriada para o mapeamento do genoma vegetal e da expressão gênica diferencial em diversos tecidos. O propósito deste projeto de pesquisa é a colaboração no esforço de sequenciamento de ESTs que será realizado pelo consórcio de laboratórios ONSA-SUCEST. Este projeto não somente objetiva a realização do sequenciamento para levar a cabo as metas do consórcio, mas também o estabelecimento da tecnologia de sequenciamento em larga escala, tão importante para o perfil da ciência biomédica nacional e internacional. Os resultados obtidos nos diversos esforços de natureza semelhante são testemunho da importância de tais projetos para o avanço do conhecimento científico e para futuras aplicações biotecnológicas.Item Purine synthesis pathway and identification of novel genes(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueWe are currently involved as a sequencing laboratory in the SUCEST project. Our Data Mining purpose is to search the EST database generated from the SUCEST effort in two themes: the first is the identification of genes involved in the purine synthesis and recycling pathways. The second theme of our data mining effort is an exploratory analysis of those EST sequences whose identity is unknown from the first database searches, the so called “no hit sequence". The purine nucleotide pathways are of central importance to all living organisms and have been investigated as a possible target for chemotherapy due to differences between the disease agents and their hosts. In human cells the purine nucleotides are synthesized from non-nucleotide precursors such as amino acids, ammonia and carbon dioxide. Purines can also be recycled through the salvage pathway. Another important enzyme involved in the salvage as well as de novo pathway is the enzyme responsible for the synthesis of the PRPP substrate, PRPP synthetase (PRS), utilized in all PRTases reactions. The knowledge of sugarcane purine synthesis enzymes will open the possibility of using such enzymes as a target for drugs to combat phytopathogen agents, as is being done with several parasitic targets. With our participation in the project as a sequencing laboratory, we have initiated a preliminary Data Mining effort using the following strategy. Representative enzyme sequences for each member of the purine de novo synthesis and recycling pathways have been chosen from the NCBI database. Those peptide sequences are being used to search the entire translated SUCEST database using the BLAST facility available. Retrieved EST clones are further tested for the statistical significance of the alignment by a Monte Carlo shuffling algorithm. To calibrate the Monte Carlo analysis, known protein sequences of divergent rate along the phylogenetic three have been used. Those sequences are compared to each other and to the EST clones. The resulting table of p-values indicates the degree of divergence of each enzyme along different rate and with the Sugarcane EST clones. Preliminary results employing this strategy allowed us to identify at least one potential case of polymorphism in Sugarcane, of the protein PRPP synthetase, a key enzyme of the purine synthesis pathway. Interestingly, two important genes, glutamine-PRPP-amidotransferase and GAR transformylase, from the de novo synthesis pathway have not been found in the SUCEST database so far. Those missing genes pose interesting questions that may be further investigated, such as if those genes are of such low abundance as to be undetected in the current libraries. Alternatively glutamine-PRPP-amidotransferase and GAR transformylase y be so divergent as to avoid detection in our search strategy. The possibility that Sugarcane would employ an alternative purine metabolism is unlikely since all the other enzymes involved have been identified with high degree of similarity to the known sequences. In every genome effort undertaken to date a variable number of unidentified sequences are encountered. Those genes are of great interest since they may be responsible for important and yet unknown pathways of the organism studied. The EST genome sequencing effort of the sugarcane plant isn't an exception. Several EST sequences are being accumulated as “no hit sequences" that aren't initially identified by the standard method of search employed. Our purpose is to analyze as many as possible of those sequences in an attempt to identify sequences with marginal similarity scores. Although such undertaking is laborious and will not permit the detailed examination of all the unknown sequences, we may be able to identify if potentially valuable information is being lost as "no Hit sequences". If such is the case, it would justify further efforts to develop automatic search methods to explore those sequences. The strategy employed will be of collecting individual sequences and perform database searches, against the public databases, using the translated peptide sequence as query. Such approach is known to increase the sensitivity of the search and return more reliable results. Marginal identities will be further analyzed by statistical methods, such as the Monte Carlo algorithm, and phylogenetic reconstruction if the sequence length permits. The identified sequences will be made available for further study by the data mining laboratory working on the pathway specific to it or will be catalogued for further analysis.Item Estudos estruturais e moleculares da enzima fosfopanteteinil transferase de Xanthomonas albilineans: alvo molecular para o desenvolvimento de novos agroquímicos para cultura de cana-de-açúcar(2013-09-27) Lima, Gustavo Machado Alvares deA cana-de-açúcar é uma das principais fontes de energia renovável, constituindo a matéria-prima mais importante na busca por energia limpa e sustentável. Os benefícios ambientais provenientes da produção e do uso dos derivados de cana-de-açúcar fomentam o desenvolvimento de métodos e produtos que aumentem, de modo sustentável, a geração de bioenergia. Dentre os diversos fatores limitantes para o aumento da produção de cana-de-açúcar, destaca-se a ocorrência e a severidade de fitopatologias como a escaldadura das folhas. Essa doença, causada pela bactéria Xanthomonas albilineans, causa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda de qualidade do caldo extraído que determinam prejuízos econômicos significativos para os agricultores. Atualmente, não há alternativas disponíveis para o controle químico ou biológico dessa fitopatologia. Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas moléculas como defensivos agrícolas que sejam eficazes, seletivas, de baixo custo e impacto ao meio ambiente. A X. albilineans produz uma família de antibióticos e fitotoxinas conhecida como albicidinas. As enzimas envolvidas na biossíntese de albicidinas são alvos moleculares extremamente atrativos para o planejamento de novos agroquímicos. Entre as enzimas dessa via, destaca-se a fosfopanteteinil transferase (XaPPT, E.C. 2.7.8.7), uma enzima essencial para o desenvolvimento da X. albilineans. Essa dissertação está dividida em duas partes: i. estudos computacionais e ii. estudos experimentais. Na parte computacional foi desenvolvida uma nova ferramenta, denominada ViTaMIn para auxiliar o desenvolvimento de modelos tridimensionais (3D) de proteínas. A enzima XaPPT foi utilizada como estudo de caso para validar o programa. Os resultados obtidos indicaram que ViTaMIn foi capaz de auxiliar a construção de um modelo 3D robusto da XaPPT. Além disso, foi verificado que ViTaMIn é uma alternativa útil para usuários iniciante e experientes na modelagem molecular. O modelo de XaPPT construído foi utilizado na triagem virtual para a identificação de novos candidatos a inibidores. A estratégia incluiu a aplicação de filtros moleculares e estudos de docagem molecular que resultaram na seleção de 10 candidatos a inibidores da enzima-alvo. Na parte experimental, o cultivo de culturas de X. albilineans foi padronizado e estudos de biologia molecular com a XaPPT conduzidos a partir da extração de DNA genômico da bactéria. Estratégias clássicas e modernas foram empregadas para a clonagem da XaPPT. Os resultados obtidos indicaram a obtenção de proteína expressa na forma solúvel. Os trabalhos integrando estudos computacionais e experimentais apresentados nessa dissertação de mestrado significam importantes contribuições no desenvolvimento de bases científicas sólidas para o desenvolvimento de novos candidatos a agroquímicos para a cultura de cana de açúcar.