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Item Interferência de peptídeos contendo histidinas na estrutura de proteínas recombinantes: um estudo aplicado à adenina fosforibosil transferase (APRT) de Leishmania tarentolae.(2008-09-10) Caruso, Cecilia SulzbacherEnquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e α-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 ± 0,20 e 7,7 ± 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice α . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-α do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro.Item Medidas de tempos de relaxação spin-rede em cristais mistos de halogenetos alcalinos.(2007-04-19) Tannus, AlbertoNeste trabalho, utilizando técnicas magneto-ópticas, estudamos tempos de relaxação spin-rede (T1) do estado fundamental de centros \'F\' e, cristais de halogenetos alcalinos (KCl-KBr). Descrevemos um sistema semi-automático para medidas ópticas de T1, capaz de medir tempos de relação curtos (~1mS), baseado na medida do Dicroísmo Circular magnético (DCM) que apresentam aqueles sais quando portadores de centros paramagnéticos. Obtivemos a dependência de T1 com o campo magnético H (até 65 Kgauss), bem como os espectros de DCM para diferentes concentrações nas matrizes mistas. Uma teoria desenvolvida por Panepucci e Mollenauer (1) para matrizes puras, foi adaptadas para explicar a relaxação spin-rede nos cristais mistos. Os resultados obtidos para o processo direto (T~2.0 K), confrontados com auqela teoria, mostram que o mecanismo de relaxação dominante até 25 KGauss continua sendo a modulação por fônons da interação hiperfins entre o elétron \'F\' e os núcleos vizinhos.