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Item Isolamento e caracterização do cDNA,produção heteróloga e análise estrutural de BbKI: um inibidor de proteinase de Bauhinia bauhinioides(2013-11-20) Vieira, Débora FernandaInibidores tipo Kunitz são proteínas de aproximadamente 20 kDa, que geralmente possuem de dois a quatro resíduos de cisteína, formando uma ou duas pontes dissulfeto, sendo responsáveis por inibir uma ou diversas serina proteinases com grande especificidade. Eles são importantes tanto por atuarem em situações de defesa na planta como por estarem envolvidos na inibição de diversas proteinases, como aquelas presentes na cascata de coagulação sanguínea, no processo inflamatório ou e até mesmo atuarem na supressão de tumores. Este trabalho teve como alvo o estudo de um inibidor tipo Kunitz encontrado em sementes de Bauhinia bauhinioides (Martius) Macbr., denominado BbKI (Bauhinia bauhinioides Kallikrein Inhibitor). Um fragmento gênico codificando a seqüência primária madura de BbKI foi amplificado por RT-PCR e clonado no vetor pGEM-T. Através da técnica de RACE (3 e 5) foi possível constatar que a proteína é sintetizada inicialmente como um prepropeptídeo com a seguinte estrutura: peptídeo sinal (19 resíduos de aminoácidos), proteína madura (164 resíduos), e peptídeo C-terminal (10 resíduos). A presença do peptídeo sinal demonstra que a proteína segue uma rota de síntese via retículo endoplasmático e sugere que este inibidor possa seguir para outro compartimento celular, sinalizado pelo peptídeo C-terminal. Para avaliar se este peptídeo não seria um mero inibidor da atividade biológica, foram feitas duas subclonagens em vetores do sistema pET: uma com o fragmento gênico codificador para BbKI madura, e outra adicionando a seqüência codificante para a porção C-terminal na proteína madura. As proteínas recombinantes foram expressas em células de E. coli BL21(DE3), as quais foram purificadas através de cromatografia de afinidade (Ni-NTA) e filtração em gel, apresentando a massa molecular esperada de 20 kDa. Testes de atividade com tripsina mostraram que ambas as proteínas são biologicamente ativas, embora com diferentes constantes de inibição. Estudos de Dicroísmo Circular revelaram estruturas secundárias similares para ambas as proteínas. Quando analisado por espectroscopia de fluorescência, o inibidor maduro mostrou-se estável numa ampla faixa de pH. A proteína madura recombinante foi ainda cristalizada e o cristal foi difratado por raios X até a resolução máxima de 1,9 A, permitindo a resolução e o refinamento de sua estrutura. A análise da estrutura revelou que o inibidor apresenta um enovelamento -trefoil que é típico nos inibidores tipo Kunitz previamente estudados. Sua estrutura terciária mostrou que no centro ativo o loop inibitório está exposto ao solvente e que os únicos W e C ficam escondidos no interior da proteína, rodeados por resíduos hidrofóbicosItem Produção e caracterização de enzimas de Streptomyces clavuligerus relacionadas com a síntese do ácido clavulânico(2013-01-09) Vieira, Débora FernandaÁcido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, produzido por Streptomyces clavuligerus, usado clinicamente em combinação com antibióticos β-lactâmicos para tratar infecções bacterianas resistentes. Apesar da produção industrial de AC já ser bem estabelecida muitos aspectos importantes relacionados com sua biossíntese permanecem carentes de estudo. Sabe-se que a via de síntese do AC envolve no mínimo 8 passos enzimáticos sendo os primeiros passos mais abordados. Por exemplo, as enzimas N2-(2-carboxietil) arginina sintase (CEAS), β-lactama sintase (BLS) e proclavaminato amidino hidrolase (PAH) são as responsáveis pela primeira, segunda e quarta reações enzimáticas respectivamente. Estudos mutagênicos recentes em S.clavuligerus relacionaram cópias extras dos genes ceas, bls e pah (ceas1, bls1 e pah1) com essa via porém nenhum ensaio enzimático foi relatado. Embora os passos finais da via ainda não estejam completamente estabelecidos, a ação de algumas enzimas putativas, como a codificada por orf12, mostraram ser essenciais a produção do AC. Assim, com o objetivo de aumentar a informação disponível sobre a biossíntese do AC estudamos quatro de seus membros: CEAS1, BLS1, PAH1 e a proteína putativa codificada pela orf12. Os genes foram isolados a partir do DNA genômico de S. clavuligerus por PCR e clonados em vetores para produção das proteínas recombinantes em E.coli. Os protocolos de expressão foram estabelecidos para CEAS1, PAH1 e ORF12 e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal. BLS foi obtida de forma isolúvel. As proteínas solúveis foram caracterizadas por meio de técnicas bioquímicas e estruturais. As análises de CEAS1 e PAH1 foram comparadas com informações já obtidas para as isozimas CEAS2 e PAH2, respectivamente. Assim, as análises de oligomerização das proteínas resultaram em uma mistura de oligômeros (monômero, dímero e tetrâmero) para CEAS1, na forma hexamérica para PAH1 e na forma dimérica para ORF12, estando de acordo com as formas solúvel e cristalográfica de CEAS2 (dímero e tetrâmero) e PAH2 (hexâmero). Espectros de dicroísmo circular mostraram que CEAS1 e PAH1 possuem um enovelamento do tipo α/β sendo estáveis até 35ºC e numa ampla faixa de pH. Os parâmetros termodinâmicos da interação entre CEAS1 e o cofator Mg+2 foram determinados mostrando que é entropicamente dirigida, com uma estequiometria de ligação de 4 : 1, com uma constante de afinidade na ordem de micromolar (KD = 1,76 ± 0.23 µM). Análises realizadas com as técnicas de reação acoplada, de Cromatografia Líquida de Alta Pressão acoplada a Espectrometria de Massas (LC-MS) e de Calorimetria de Titulação Isotérmica mostraram que CEAS1, assim como CEAS2, apresenta atividade sob o substrato gliceraldeído-3-fosfato, porém sem a formação do produto final N2-(2-carboxietil)arginina. Por outro lado, a proteína recombinante PAH1 mostrou ser inativa sobre o substrato análogo, N-α-acetil-L-arginina. Assim, apesar das isozimas manterem um padrão estrutural, podem ter mecanismos de ação distintos. Em relação a ORF12 esta proteína foi classificada com uma β-lactamase com atividade esterase de acordo com nossos estudos realizados com os substratos cefalosporina C e p-nitrofenil acetato.