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Item Interação de proteínas com modelos de microdomínios lipídicos e membranas biológicas(2017-05-16) Munte, Claudia ElisabethMicrodomínios lipídicos são subdomínios específicos da membrana plasmática, ricos em fosfolipídios saturados, esfingolipídios e colesterol. Possuem um papel importante em uma série de processos biológicos, em especial no transporte e movimento intracelular e na transdução de sinal. Proteínas específicas poderão se ligar permanentemente (por ex. Caveolina) ou temporariamente (por ex. TNFR-1) a esses domínios, como mecanismo regulatório de sua atividade biológica. Microdomínios são, também, sítios preferenciais para a formação de formas patológicas do peptídeo beta-amilóide (Abeta) associado à doença de Alzheimer. Um bom modelo de microdomínios pode ser obtido através da associação de lipídios de cadeia longa e cadeia curta em proporções específicas de forma a obter bicelas. O modelo pode ser aprimorado se dopado com esfingolipídios e colesterol. Bicelas tendem a se orientar em campos magnéticos fortes, sendo que uma isotropia magnética pode ser obtida para bicelas pequenas em determinadas faixas de temperatura. Nesse projeto serão produzidas pequenas bicelas, compostas de fosfolipídios saturados de cadeia curta e longa, sem ou com colesterol e esfingomielina. As amostras serão caracterizadas com auxílio das técnicas de Ressonância Magnética Nuclear de alta resolução (1H e 31P) e de Ressonância Paramagnética Eletrônica, em diferentes temperaturas e concentrações. Sua integridade e homogeneidade estrutural deverá ser comprovada por microscopia eletrônica e/ou microscopia de força atômica. A utilização dessas bicelas magneticamente isotrópicas, como modelo de membranas ou microdomínios lipídicos, dar-se-á em estudos de interação com proteínas e peptídeos. Duas potenciais candidatas a esses estudos são as diferentes variantes do peptídeo Abeta da doença de Alzheimer, e as proteínas intracelulares transportadoras de ácidos graxos FABPs (Fatty Acid Binding Proteins).Item Estruturas de proteínas de organismos patogênicos determinadas por ressonância magnética nuclear de alta resolução(2017-05-11) Munte, Claudia ElisabethO presente projeto prevê a determinação da estrutura de duas proteínas: PfPIrx, uma Plasmoredoxina recentemente descoberta no parasita Plasmodium falciparum, envolvida na manutenção de seu equilíbrio redox, e Ts14, uma das glicoproteínas de baixo peso molecular de Taenia solium utilizadas no diagnóstico da neurocisticercose. As estruturas serão resolvidas utilizando-se a técnica de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) multidimensional de alta resolução, aplicada a amostras isotopicamente enriquecidas com 13C e 15N.Item Ressonância magnética nuclear na determinação de estrutura de proteínas: aplicação à mutante His15Ala de HPr de staphylococcus aureus.(2011-01-07) Munte, Claudia ElisabethA técnica de espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR) de alta resolução foi utilizada para estudos estruturais em duas biomoléculas: a proteína HPr da bactéria Staphylococcus aureus, e o peptídeo C da insulina humana. Ambas estão relacionadas com a regulação da absorção de glicose pelas células, no primeiro caso em procariontes, e no segundo em organismos superiores. A proteína HPr (\"Histidine-containing protein\") de Staphylococcus aureus é uma das componentes centrais do sistema PTS (fosfoenolpiruvato:açúcar-fosfotransferase) de translocação grupal, responsável pelo transporte ativo de açúcar para o interior da célula bacterial. Nesse processo, a His15 do sítio ativo de HPr é fosforilada pela enzima EI, transferindo, a seguir, o grupo fosfato para a enzima EUA A mutação His15→Ala interrompe a transferência do grupo fosfato; apesar disso, a afinidade entre HPr(H15A) e as enzimas EI/EIlA se mostrou semelhante à da nativa. Utilizando técnicas de NMR bidimensionais (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC) etridimensionais (HNCA, HNCO, NOESY-HSQC) foi determinada a estrutura da mutante His15→Ala de HPr de S. aureus. Sua estrutura consiste de um sanduíche-aberto, composto de 3 hélices-a paralelamente empacotadas contra uma folha formada por 4 fitas-β anti-paralelas. Esse padrão é encontrado em todas as proteínas HPr já determinadas em diversas espécies, divergindo, porém, significativamente da estrutura previamente publicada para a proteína nativa de S. aureus com relação à orientação relativa de alguns elementos de estrutura secundária. Através de uma análise detalhada dos espectros NOESY das proteínas HPr mutante e nativa puderam ser encontradas diferenças conformacionais na região em tomo do sítio-ativo. Uma comparação com as outras estruturas de HPr já publicadas revelou uma maior semelhança entre a proteína mutante de S. aureus e a proteína no complexo HPr/EI de E. coli, fornecendo evidências de que a estrutura encontrada para a mutante represente a conformação assumida pela proteína HPr no momento de sua interação com a enzima EI, assim explicando a sua afinidade inalterada. O peptídeo-C da proinsulina é importante para a biosíntese da insulina, tendo sido considerado, por muito tempo, biologicamente inerte. Estudos recentes em pacientes diabéticos retomaram a discussão quanto a sua possível atividade reguladora. Utilizando a técnica de espectroscopia de NMR bidimensional (COSY, TOCSY, NOESY), foram realizados estudos estruturais no peptídeo-C da proinsulina humana. Quando dissolvido em 50%/50% água e TFE, o peptídeo-C apresentou 3 regiões centrais (9-12, 15-18, 22-25) com tendência à formação de dobras, uma região N-terminal (2-5) com 2 conformações em voltas-β tipo I e I, e uma região Cterminal (26-31), de conformação extremamente bem definida, incluindo uma volta-β tipo III\' (27-30). Em estudos descritos na literatura já foi demonstrada a atividade do pentapeptídeo C-terminal (EGSLQ), na forma de interações quirais com um receptor ainda desconhecido. Estudos anteriores por NMR prevêem a existência de uma estrutura na região C-terminal, a qual foi denominada de \"CA-Knuckle\". Nossa proposta é que a estrutura aqui obtida para o pentapeptídeo C-terminal seja justamente o \"CA-Knuckle\", representando o sítio-ativo do peptídeo-C da proinsulina humana.Item Estrutura molecular e espectros de EPR do composto monocristalino CuBr2(fdmp)2.(2010-12-10) Munte, Claudia ElisabethEstão sendo apresentados, neste trabalho, estudos estruturais e magnéticos do composto de [CuBr2(fdmp)2] utilizando as técnicas de difração de Raio-X e espectroscopia de EPR. a complexo cristaliza no grupo espacial P21/n com a=8.1653(47)Å, b=10.432(3)Å, c=13.385(4)Å, β=100.12(4)° e Z=2. Os íons de Cu(II), que estão em coordenação quadrado-planar trans ligando-se a dois Nitrogênios e dois Bromos, se encontram em centros de inversão. Somente urna linha de EPR e observada, proveniente do colapso das ressonâncias relativas aos dois íons de Cu(II) magneticamente não equivalentes, causado pela interação de troca. Devido a diferença significativa entre os pesos atômicos do Nitrogênio e Bromo, não e esperada urna simetria axial para o tensor g como é comum ocorrer em vários complexos de Cu(II); de fato, a decomposição de g cristalino para os dois g moleculares revela três autovalores distintos. Alem disso, a direção de maior g não coincide exatamente com a normal ao quadrado-planar, como é comum nesses complexos: se encontra rodada de ∼ 5° em direção ao Bromo, caracterizando um estado fundamental do tipo dx2-y2 com mistura de dyz. Outro fato incomum verificado foi a dependência do fator g com a freqüência e a presença de contribuições não-seculares, característicos de sistemas em que a freqüência de troca é próxima a freqüência de Larmor. Uma analise da variação angular da largura de linha de ressonância foi utilizada para a determinação do parâmetro de troca J. Está também incluído, neste trabalho, um método numérico de decomposição de g cristalino em g moleculares e sua comparação com métodos da literatura.