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Item Estrutura cristalográfica da enzima triosefosfato isomerase de Bacillus stearothermophilus e desenho racional de drogas contra a doença do sono(2013-12-09) Delboni, Luis FernandoO atual crescimento do número de estruturas tridimensionais de proteínas está produzindo um banco de dados de estruturas que é muito útil como ponto de partida para o desenvolvimento de novas moléculas relevantes do ponto de vista médico tais como drogas e vacinas. Neste trabalho, parte do projeto de desenvolvimento de novas drogas contra a doença do sono foi feita baseada nos estudos cristalográficos de ligação de compostos e de modelagem molecular de duas enzimas glicolíticas presentes no glicossomo de T. brucei. Como o alvo para novas drogas e o ciclo de glicólise, o qual também é presente nos seres humanos, o novo ligante deve ser seletivo. Frutose-1,6-bisfosfato aldolase (ALDO) é uma das proteínas alvo para o desenho racional de drogas. A análise estrutural e estudos cristalográficos da ALDO de T. brucei foram feitos, através do uso de proteína produzida em grandes quantidades por via recombinante. Vários possíveis sítios de seletividade foram encontrados em ALDO de T. brucei quando comparada as três seqüências das isoenzimas humana, tendo como base a estrutura tridimensional da isoenzima ALDO A. O braço flexível da região C-terminal é um forte alvo para compostos seletivos devido a não-conservação das seqüências. Cristais foram crescidos e padrões de difração de raios-X foram obtidos até 3.0Å, mas ainda os cristais são pequenos e mostram-se sensíveis a radiação. Triosefosato isomerase (TIM) é outra ptoteína alvo analisada neste trabalho. A estrutura da TIM de T. brucei é conhecida a alta resolução. Cristais de proteína expressa em bactérias foram obtidos após extensivos experimentos. Foi identificado que usar proteína recentemente preparada é essencial para obter cristais que apresentem boa qualidade de difração. Depois de obtidos cristais de proteína expressa em grades quantidades, foram feitos experimentos de difusão de novos inibidores, coleta de dados de difração e análises das estruturas dos possíveis complexos. A conhecida estrutura em volta flexível da TIM fecha quando se liga o substrato ou um inibidor análogo ao substrato no sítio ativo. Desenho racional de drogas tem sido seguido usando como padrão a conformação fechada da estrutura em volta. No entanto, com a obtenção de um novo complexo, no qual a estrutura em volta adota a conformação aberta foi feita uma busca de novos compostos em bancos de dados, que não fossem derivados de fosfatos e fosfoantos, através do programa DOCK. Com este procedimento são propostos novos compostos guia os quais serão utilizados no ciclo do desenho racional de drogas. A estrutura da triosefosfato isomerase de Bacillus stearothermophilus que apresenta estabilidade térmica em complexo com o inibidor competitivo 2PG foi determinada por cristalografia de raios-X à resolução de 2.8Å. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o programa XPLOR. Promediação da densidade eletrônica de ordem dois e nivelamento do solvente foram aplicados para melhorar a qualidade do mapa. Ambos os sítios ativos estavam ocupados pelo inibidor e a estrutura emvolta flexível adota a conformação fechada em ambas as subunidades. O fator cristalográfico R é de 17,6% com boa geometria. Bacillus stearothermophillus é considerado um organismo de estabilidade térmica moderada. Encontram-se disponíveis cinco estruturas de triosefosfato isomerase de organismos mesofílicos. A estrutura obtida neste trabalho é a primeira TIM reportada que apresenta estabilidade térmica. Vários artigos têm listados fatores de estabilidade térmica, os quais foram analisados em todas as estruturas de TIM disponíveis. Neste trabalho foi conduzida uma comparação entre a estrutura termofílica e as mesofílicas disponíveis, da qual se concluiu que a interação hidrofóbica na formação do dímero, e o alto número de prolinas são os mais importantes fatores que contribuem para a estabilidade térmica da TIM de B.stearothermophilus. Também concluiu-se que a razão Arg/(arg+Lys) é elevada em TIM de B. stearothermophilus mais devido ao baixo número de lisinas do que a um alto número de argininas. Analisou-se as argininas na TIM de B. stearothermophilus como também as interações das argininas e lisinas em todas as outras estruturas de TIM e não foi possível relacionar o valor aumentado da razão Arg/(arg+Lys) com a estabilidade térmica, fator este indicado anteriormente como importante para a estabilidade térmicaItem Cristalografia estrutural: estudos da hemoglobina do peixe Leporinus frederici e determinação de estruturas de pequenas moléculas por difração de raios-x(2013-11-20) Delboni, Luis FernandoUma das várias formas da hemoglobina do peixe Leporinus Frederici (piava) não apresenta efeito Borh (variação da afinidade ao O2 com o pH). Purificação, caracterização e experimentos de cristalização foram conduzidos visando a determinação da estrutura através de difração de raios X, embora sem resultados positivos. O espectro óptico desta forma particular de hemoglobina foi medido no intervalo de 300-700 nm e subseqüentemente simulado, interpretado e comparado com o espectro da humana. Em outra área do trabalho experimental, três pequenas estruturas moleculares foram determinadas: uma é um intermediário na síntese de alcalóides, com um esqueleto sarpagina; outra é um dipeptídeo complexado com Cu2+; e a terceira é um complexo de picrato com Ce3+. As intensidades das reflexões foram medidas com um difratômetro automático de quatro ciclos CAD-4. As estruturas foram resolvidas por Patterson ou Métodos Diretos e foram refinadas por método de mínimo quadrado. Cetona, C19H21N3O, é um intermediário chave no caminho de reação para síntese de indoloquinolisidinas, pertence ao sistema, P21/C, a=12.200(7), b=16,795(2), c=16,655(l)Å, β=104,18(3)°, Z=8, Dc= 1,234 gcm-3, V=3308(3). As duas moléculas independentes são aproximadamente relacionadas por um centro de inversão, a principal diferença sendo relativa às configurações dos grupos nitril e metil. As moléculas enantioméricas estão mantidas por ligação de hidrogênio através do N(3)-O(1\') e N(3\')-O(1). A junção N(1)-C(6) é trans e o grupo CH2CN é axial. L-(triptofil)-L-glicinato-cobre(II). C13H13CuN3O3, um composto modelo para conseguir informações para interpretar os dados disponíveis para proteínas azuis, é ortorrômbico, P212121, a=8,284(6), b=9,345(2). c=16.503(2)Å, Z=4, Dc=1.678 gcm-3, V=1277(2). O íon Cu2+ é coordenado por um oxigênio e dois nitrogênios de um dipeptídeo e com um oxigênio de um ligante simetricamente relacionado. A estrutura polimérica resultante está alinhada com o eixo b e tem uma estabilidade maior devido a uma ligação de hidrogênio entre o oxigênio carbonil de um dipeptídeo e o nitrogênio do triptofano do ligante vizinho. A coordenação é essencialmente quadrado planar. O complexo de picrato com Ce3+, CeO33N9C18H30, foi analisado dentro de um grande programa de pesquisa para estudar a química de coordenação dos lantanóides. Duas formas cristalinas são estudadas: uma é monoclínica, P21/n, a=7,799(2), b=26,925(2), c=17,465(2)Å, β=98,93(3)° , Z=4, Dc= 1,908 gcm-3, V=3623(2) e a outra é monoc1ínica, C2/c, a=40,225(5), b=8,08(4), c=24,35l(9), β=111,46(2), Z=8, Dc= 1,893 gcm-3, V=7300(8). A primeira é relativamente instável sobre a incidência de raios-X e embora a medida das intensidades apresentasse erros sistemáticos significantes, a estrutura pode ser resolvida. O número de coordenação dos dois complexos é 9 e os poliedros de coordenação são intermediários entre antiprisma quadrado monoencapuzado e prisma trigonal triencapuzado