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Item Cristalografia, modelagem molecular e planejamento de substâncias de interesse biológico(2017-05-31) Mascarenhas, Yvonne PrimeranoO objetivo deste projeto é a realização de trabalhos visando à determinação da estrutura molecular de proteínas. Utilizando-se técnicas computacionais e bancos de dados de estrutura primária e de estruturas moleculares de proteínas determinadas pelos métodos de difração serão feitas previsões de estrutura molecular de proteínas com estrutura primária conhecida. Poderão também ser analisadas variações conformacionais decorrentes de associação de proteínas com substratos. Sempre que houver disponibilidade de quantidade adequada de amostras serão realizados ensaios de cristalização visando à obtenção de monocristais adequados para uso por métodos de difração de raios-x.Item Modelo tridimensional para representar estrutura ou parte de estrutura protéica e kit(2017-05-29) Garratt, Richard CharlesO projeto é um pedido de extensão de patente via PCT para fora do país baseado no depósito brasileiro feito no INPI no dia 19 de fevereiro de 2003 e cujo resumo segue: "A presente invenção refere-se a componentes modulares para serem usados na construção de modelos moleculares representando estruturas protéicas. Mais especificamente, a invenção revela componentes que simbolizam regiões da proteína que não formam elementos de estrutura secundária e partes de elementos da estrutura secundária bem como suas conexões, para a construção de modelos representativos do enovelamento de qualquer estrutura protéica, ou ainda, modelos proporcionais ao tamanho real por meio da determinação de uma escala. Ditos modelos são úteis para finalidades pedagógicas e a visualização de estruturas protéicas em trabalhos de pesquisa na área."Item Estudo dos genes de micro-exon (MEGs) do parasita humano Schistosoma mansoni e seus produtos protéicos(2017-05-29) Marco, Ricardo deEste projeto tem como objetivo estudar genes de micro-exons (MEGs) e seus produtos proteicos que se encontram na interface parasita-hospedeiro. Realizaremos a expressão das principais isoformas de alguns PCMs (proteínas codificadas por micro-exon genes) em sistema heterólogo para caracterização de propriedades biofísicas e ensaios para buscando esclarecer a função destas proteínas. Ensaios de duplo-híbrido serão realizados com o intuito de buscar possíveis interações entre PCMs e proteínas de leucócitos humanos. Além disso, analises bioinformáticas compararão a estrutura da MEGs nos três organismos do gênero Schistosoma com genoma disponíveis, o S. mansoni, S. japonicum e o S. Haematobium, com a finalidade de entender melhor a evolução desta classe de genes.Item Biofísica estrutural dos receptores nucleares e proteínas relacionadas(2017-05-29) Polikarpov, IgorOs receptores nucleares estão dentre as mais importantes moléculas envolvidas na regulação intracelular, pois participam na transmissão de diferentes sinais internos e externos para a regulação de programas genéticos. A programação genética estabelecida ou modificada por essas proteínas afeta praticamente todos os aspectos da vida de organismos multicelulares. A regulação transcricional e a seletividade promovida pelos receptores nucleares estimulam a intensa pesquisa que vêm sendo realizada na tentativa de decifrar a complexa rede de eventos moleculares que promovem a sua capacidade de regulação da transcrição e descobrir as regras que definem seu controle, no espaço e no tempo, sobre as interações proteína-proteína e proteína-DNA, abrindo possibilidades para o desenvolvimento de drogas mais eficientes com valores terapêuticos superiores. No presente projeto, planeja-se estudar os receptores nucleares por cristalografia de proteínas, espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), métodos bioquímicos e biofísicos, bem como por simulações biocomputacionais, para se entender como a ligação de ligantes específicos (agonistas e antagonistas) induz respostas conformacionais na estrutura tridimensional dos receptores e influencia seus estados de oligomerização e as interações com proteínas co-reguladoreas (co-ativadoras e co-repressoras), bem como modifica a sua estabilidade. Planeja-se também estudar o reconhecimento dos elementos responsivos de DNA por receptores nucleares por cristalografia de proteínas, SAXS e anisotropia de fluorescência. Finalmente, planeja-se investigar papel de dinâmica dos receptores nucleares no seu funcionamento, objetivando determinação dos caminhos preferenciais de dissociação dos ligantes dos receptores nucleares através de simulações computacionais pro dinâmica molecular e os estudos experimentais das mudanças da mobilidade dos receptores usando a técnica de troca hidrogênio/deutério em combinação de espectroscopia de massa. É importante ressaltar que estas são metas com impacto imediato na procura racional de agonistas ou antagonistas hormonais e se inserem dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de receptores nucleares com vínculos estreitos com os interesses da indústria farmacêutica, da medicina e do setor produtivo.Item Interação de proteínas com modelos de microdomínios lipídicos e membranas biológicas(2017-05-16) Munte, Claudia ElisabethMicrodomínios lipídicos são subdomínios específicos da membrana plasmática, ricos em fosfolipídios saturados, esfingolipídios e colesterol. Possuem um papel importante em uma série de processos biológicos, em especial no transporte e movimento intracelular e na transdução de sinal. Proteínas específicas poderão se ligar permanentemente (por ex. Caveolina) ou temporariamente (por ex. TNFR-1) a esses domínios, como mecanismo regulatório de sua atividade biológica. Microdomínios são, também, sítios preferenciais para a formação de formas patológicas do peptídeo beta-amilóide (Abeta) associado à doença de Alzheimer. Um bom modelo de microdomínios pode ser obtido através da associação de lipídios de cadeia longa e cadeia curta em proporções específicas de forma a obter bicelas. O modelo pode ser aprimorado se dopado com esfingolipídios e colesterol. Bicelas tendem a se orientar em campos magnéticos fortes, sendo que uma isotropia magnética pode ser obtida para bicelas pequenas em determinadas faixas de temperatura. Nesse projeto serão produzidas pequenas bicelas, compostas de fosfolipídios saturados de cadeia curta e longa, sem ou com colesterol e esfingomielina. As amostras serão caracterizadas com auxílio das técnicas de Ressonância Magnética Nuclear de alta resolução (1H e 31P) e de Ressonância Paramagnética Eletrônica, em diferentes temperaturas e concentrações. Sua integridade e homogeneidade estrutural deverá ser comprovada por microscopia eletrônica e/ou microscopia de força atômica. A utilização dessas bicelas magneticamente isotrópicas, como modelo de membranas ou microdomínios lipídicos, dar-se-á em estudos de interação com proteínas e peptídeos. Duas potenciais candidatas a esses estudos são as diferentes variantes do peptídeo Abeta da doença de Alzheimer, e as proteínas intracelulares transportadoras de ácidos graxos FABPs (Fatty Acid Binding Proteins).Item SMOLBNET 2.0: estudos estruturais de proteínas associadas a infecção de trypanosomatídeos, bem como de seus complexos com moléculas que participam na infecção(2017-05-15) Reboredo, Eduardo HorjalesNos últimos vinte anos, muitos laboratórios têm procurado identificar proteínas de superfície de Trypanosoma cruzi que estiveram implicadas em invasão celular. As conclusões destes trabalhos apresentam um processo de múltiplos passos, envolvendo diversas moléculas, tanto do parasita quanto do hospedeiro, em uma serie concertada de eventos que conduz à mobilização de Ca2+ em ambas as células. Este projeto plasma uma colaboração entre o grupo de cristalografia de proteínas do IFSCAJSP (EHR, HHMT e MD) e o laboratório de Biologia Celular e Imunobiologia de Parasitas do DMIP/UNIFESP (RM e DB), para usar a determinação estrutural cristalográfica e a Biologia Estrutural no estudo do processo de infecção de tripanosomatideos. Para restringir-nos a objetivos viáveis em 24 meses, definimos duas proteínas que já possuem estudos iniciais em relação a sua participação na infecção e que a estrutura cristalográfica poderá fornecer informação sob a função biológica e as conseqüências de inibir a proteína, sobre a capacidade infectante dos parasitas: A proteína P2l e a mevalonato quinase (Mvak), ambas de Trypanosoma cruzi. Os estudos cristalográficos que conduzam à determinação da estrutura tridimensional dessas proteínas têm um duplo objetivo: Por um lado, ajudará na compreensão profunda da função biológica dessas proteínas e de sua participação no processo de infecção. Por outro lado, como alvo em médio prazo, será decisiva na elaboração de uma estratégia de inibição da infecção, através do planejamento de inibidores específicos, que não inibam as moléculas homologas do hospedeiro. Estudos de homologia de seqüência nos levaram a formular a hipótese de que um domínio de P21 pode ter enovelamento de inibidor de proteases tipo Kunitz, hipótese que será estudada em este projeto e que a estrutura cristalográfica permitirá esclarecer, assim como quais são os aminoácidos com alta probabilidade de estarem envolvidos em interações com o hospedeiro. No caso da mevalonato quinase o conhecimento detalhado da estrutura permitirá escolher regiões da mesma onde existam diferenças com a proteína humana, informação esta de fundamental importância na estratégia de procura de inibidores específicos para a enzima de tripanosomas. As proteínas que interagem com a membrana têm, em geral baixa solubilidade. Por isso, é necessário adequar os processos de procura de condições de cristalização introduzindo o uso de detergentes e a variação fina da temperatura como ferramentas para atingir o objetivo de obter cristais de boa qualidade de difração para serem usados na determinação da estrutura tridimensional.Item Septinas: estudos comparativos visando correlacionar estrutura e função(2017-05-12) Garratt, Richard CharlesA presente proposta foca aspectos estruturais e funcionais da família das septinas utilizando uma abordagem integrada composta por uma série de técnicas biofísicas e celulares. Embora descritos pela primeira vez em levedura a cerca de 40 anos atrás, onde são essenciais para completar o ciclo celular, septinas ainda são consideradas um componente do citoesqueleto neglegenciado em termos da sua bioquímica e fisiologia. Por exemplo, sabe-se pouco ainda sobre os fatores que controlam a formação de um heterofilamento de septinas e como isto está relacionado com a ligação e hidrólise de GTP e a associação com membranas celulares. Além disto, das dezenas de hetero-filamentos de septinas teoricamente possíveis, apenas uma única estrutura cristalográfica foi reportada até os dias de hoje e, mesmo assim, a baixa resolução. Sabe-se menos ainda sobre o papel de septinas em organismos inferiores. A presente proposta de pesquisa está dividida em três sub-projetos que abordam respectivamente aspectos da estrutura, função e relação evolucionária de septinas de diferentes organismos, incluindo o homem, um helminto, um cefalocordado e uma alga. Em termos estruturais procuraremos visualizar diretamente filamentos e protofilamentos usando microscopia eletrônica e resolver estruturas cristalográficas por difração de raios-X e RMN de septinas individuais e seus heterocomplexos, além dos seus domínios isolados na presença de ligantes, tais como GTP, GDP e Mg2+. Os resultados serão complementados por estudos funcionais visando identificar por exemplo, parceiros das septinas em algas verdes e os mecanismos de parálise de Schistosoma mansoni induzido pela inibição de septinas in vivo.Item Pulchelina, uma RIP tipo 2:isolamento, atividade biológica e estudos estruturais de suas isoformas(2017-05-12) Araujo, Ana Paula Ulian deAs proteínas inativadoras de ribossomo (RIPs) possuem atividade RNA N-glicosilase e polinucleotídeo: adenosina glicosilase. Essas proteínas despertaram interesse devido às atividades tóxicas contra células humanas e animais, criando perspectivas do seu uso como compostos antivirais e anti-tumorais em aplicações terapêuticas. O potencial uso das RIPs como imunotoxinas estimularam estudos de isolamento e caracterização de novas RIPs em diversas espécies de plantas. Elas foram encontradas em mais de 100 espécies vegetais distribuídas nas sementes, raízes, folhas e seiva, porém seu papel nas plantas ainda é objeto de especulação. Um dos fatores que contribuem para a dificuldade em elucidar as funções biológicas é o fato das RIPs compartilharem poucas propriedades além da capacidade de depurinar ribossomos, porém as pesquisas sugerem que a defesa é um dos papéis das RIPs. Ainda existem questões cruciais pendentes como as relacionadas às atividades enzimáticas e biológicas das RIPs. Sabe-se ainda que elas podem existir como diferentes isoformas na mesma planta, como já descrito para ricina e abrina. Em nosso grupo temos resultados recentes que confirmam a presença de cinco isoformas da pulchellina, uma RIP tipo 2 de Abrus pulchellus altamente tóxica, que podem diferir em nível citotóxico e potencial de ligação a açúcares como já observado para outras RIPs tipo 2. Assim, os estudos bioquímicos, biofisicos, bem como ferramentas de biologia molecular envolvidos nesse trabalho poderão ser muito úteis na caracterização destas isoformas, bem como na avaliação de seu potencial terapêutico e papel biológico.Item Determination of maromolecular structures using synchrotron radiation for the elucidation of enzymatic activities(2016-11-04) Castellano, Eduardo ErnestoO foco deste projeto é o design, construção e operação de uma estação experimental dedicada à cristalografia de proteínas no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), e sua utilização em estudos estruturais cristalográficos de diversas proteínas. Num primeiro momento, o objetivo é a determinação da estrutura e propriedades da enzima Glucosamina-6-fosfato desaminase de E.coli, a qual, tendo sido já determinada, abriu o campo para a aplicação da linha PCr para um amplo espectro de projetos de pesquisa do Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do IFSC/USP e de outros grupos de pesquisa em cristalografia do país. A linha de luz, em fase final de construção e comissionamento, inclue um espelho de raios-X cilíndrico e um monocromador de um cristal curvo, focalizando o alto fluxo da radiação síncrotron no plano horizontal, na posição da aostra. A radiação monocromática será sintonizável entre 2.0A e 1.0A, com comprimento de onda ótimo de 1.6A, escolhido de forma a maximizar o fluxo de fótons obtidos dos bending magnets do anel de armazenamento (1.37GeV). As imagens de difração serão coletadas em um sistema de deteção com placas de imagens com leitura em linha. A estação experimental contará também com sistemas de resfriamento e congelamento de cristais e um laboratório de apoio de bioquímica para cristalização, difusão de átomos pesados em cristais, montagem de cristais, com câmaras termoestabilizadas a 22 C e 4 C. Estas facilidades serão para uso de pesquisadores do país e do exterior, e deverá ser aberta para usuários externos em Setembro/97. Cerca de 30 projetos de estudos estruturais de diferentes proteínas já cristalizadas ou fase de cristalização já foram propostos, abrangendo estudos de enzimas, proteínas de plantas, toxinas, planejamento racional de drogas terapêuticas e vacinas, e enfocando projetos de grande interesse nacional.