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Item Structure and function of enzymes and auxiliary proteins from Trichoderma, active in cell-wall hydrolysis(2017-05-29) Polikarpov, IgorLignocellulosic biomass, such as sugarcane bagasse, holds a promise of environmentally friendly bioenergy production in Brazil. However, enzymatic hydrolysis, currently considered a method of choice in biomass saccharification, is hampered by considerable cell-wall recalcitrance. To make this technology sustainable and cost effective, our comprehension of cellulose enzymatic hydrolysis should be significantly improved. Here we propose to conduct systematic structure-functional studies of Trichoderma cellulases and auxiliary proteins active in cell-wall degradation using a combination of X-ray protein crystallography, biophysical and biochemical studies, molecular dynamics simulations, statistical coupling analysis aligned with the site-directed mutagenesis and enzymatic assays aiming to obtain in-depth comprehension of cellulose hydrolysis. We plan to contribute toward structural analysis of Trichoderma reesei endoglucanases by solving a crystal structure of endoglucanase II (Cel5A), main enzymatically active, but structurally uncharacterized endoglucanase of this important industrial fungus. Moreover, we will contribute toward our knowledge of Trichoderma cellulases molecular organization by solving X-ray structures of main Trichoderma harzianum endo- and exoglucanases (primarily focusing on Cel7A and Cel5A) and by comparing them with the correspondent T. reesei enzymes. We also aim to structurally characterize swollenins, non-hydrolytic proteins, shown to enhance cellulose hydrolysis catalyzed by celulases, and to study thermodynamically its interactions with cellulose. In addition, we will construct chimeric enzymes by fusing of swollenin with the cellulases and will study enzymatic properties of such chimeras. Furthermore, we will conduct systematic molecular dynamics studies of the cellulases and swollenin, and investigate their flexibility by hydrogen deuterium exchange followed by massspectrometry. Finally, we will use all these acquired knowledge to modify the proteins using site-directed mutagenesis aiming to better comprehend molecular basis of their function and to produce enzymes and their mixtures with enhanced hydrolytic properties.Item Produção heteróloga, caracterização e engenharia de Xilose isomerases para aplicação na fermentação industrial de pentoses.(2017-05-29) Polikarpov, IgorPara tornar a produção de etanol de segunda geração economicamente sustentável, é imprescindível utilizar fração hemicelulósica. As pentoses (P5), que compõem a hemicelulose, não são fermentescíveis pelas leveduras (Saccharomyces cerevisiae) utilizadas pela indústria brasileira. A xilose, uma fração predominante de P5, pode ser robustamente convertida pela ação de xilose isomerases (Xls) em xilulose, que, por sua vez, é facilmente fermentada pela S. cerevisiae. Neste projeto estamos propondo utilizar ferramentas modernas de bioinformática, genética, expressão heteróloga de alta produtividade e Biologia/Bioquímica Molecular Estrutural para identificar, clonar e expressar em larga escala Xls novas e potencialmente patenteáveis. Estamos objetivando também o estudo enzimático e de modificação das mesmas usando engenharia de proteínas, visando produzir enzimas com alta atividade enzimática e perfis de pH e temperatura compatíveis às condições do processo industrial brasileiro. Além disso, imobilizaremos as Xls otimizadas para aumentar sua vida útil e viabilizar seu reciclo. Faremos pré-tratamento do bagaço da cana para obter um hidrolisado hemicelulósico, e conduziremos testes de isomerização e fermentação simultâneos de P5 usando leveduras comerciais e industriais em condições reacionais próximas às encontradas nas usinas do País. É importante ressaltar que este processo não utiliza organismos geneticamente modificados e é, portanto mais facilmente escalonável para os processos industriais brasileiros.Item Descoberta e planejamento de novos agentes antibacterianos candidatos a defensivos agrícolas para a cultura da cana-de-açúcar: triagem biológica, química medicinal e biologia estrutural(2017-05-26) Guido, Rafael Victório CarvalhoO desenvolvimento sustentável apresenta como aspecto marcante a utilização do conhecimento científico para gerar inovações tecnológicas que auxiliam na melhoria das condições de vida dos seres humanos. O foco das pesquisas nesse segmento visa à geração de energia limpa a partir de fontes renováveis. Recentemente, o desenvolvimento sustentável foi o tema da 4ª Conferência Nacional de Ciência, Tecnologia e Inovação (4ª CNCTI) que, entre os desafios estabelecidos, elegeu a agricultura e a bioenergia como tópicos centrais para a construção de um novo padrão de desenvolvimento nacional. Os benefícios ambientais provenientes da produção e do uso dos derivados de cana-de-açúcar fomentam o desenvolvimento de métodos e produtos que aumentem, de modo sustentável, a geração de bioenergia. Dentre os diversos fatores limitantes para o aumento da produção de cana-de-açúcar, destaca-se a ocorrência e a severidade de fitopatologias como a escaldadura das folhas. Essa doença é causada pela bactéria Xanthomonas albilineans, sendo encontrada distribuída em praticamente todas as regiões do mundo onde a planta é cultivada. A escaldadura das folhas causa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda de qualidade do caldo extraído que determinam prejuízos econômicos significativos para os agricultores. Atualmente, não há alternativas disponíveis para o controle químico ou biológico dessa fitopatologia. Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas moléculas como defensivos agrícolas que sejam eficazes, seletivas, de baixo custo e impacto ao meio ambiente. O presente projeto de pesquisa visa à identificação e o desenvolvimento de novas moléculas com atividade antibacteriana, através da triagem de compostos de origem natural e sintética, biologia molecular estrutural e do planejamento em química medicinal, empregando uma combinação de métodos e estratégias avançadas, que contemplam os aspectos modernos do estado da arte no planejamento de moléculas bioativas. Os objetivos propostos neste projeto serão alcançados através do estabelecimento de bases apropriadas para o seu desenvolvimento pleno, fazendo uso da forte infraestrutura, competências e organização multidisciplinar de nosso grupo de pesquisa no Centro de Biotecnologia Molecular Estrutural - CBME (CEPID-FAPESP); do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas - INBEQMeDI (INCT-CNPq-FAPESP); e do Centro de Referência Mundial em Química Medicinal para Doença de Chagas da Organização Mundial de Saúde (OMS) do Instituto de Física de São Carlos (IFSC) da Universidade de São Paulo (USP). Um aspecto forte desta proposta é o seu caráter multidisciplinar, que levou ao estabelecimento de colaborações efetivas com pesquisadores de excelência científica em suas respectivas áreas de atuação. Outro aspecto marcante desta proposta é a criação de uma nova linha de pesquisa em Química Medicinal com foco na descoberta e planejamento de novos agroquímicos. Essa nova linha amplia o escopo e agrega valor ao conjunto de projetos conduzidos no CBME-INBEQMeDI, além disso, oferece a possibilidade de nosso grupo contribuir para o desenvolvimento sustentável do Brasil através de ações efetivas em ciência, tecnologia e inovação nas áreas estratégicas de agricultura e bioenergia.Item Aplicação dos princípios de evolução in vitro em estudos de função e estrutura da hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase de Leishmania tarentolae(2017-05-26) Thiemann, Otavio HenriqueAs leishmanioses estão dentre as mais devastadoras doenças humanas. Entretanto não se possui uma medida de tratamento eficiente e segura dos indivíduos infectados. Estes organismos se destacam por serem auxotróficos para purinonucleotídeos. Com a finalidade de desenvolver novas formas de quimioterapia, a via de recuperação se apresenta como uma ideia candidata a esse fim. Objetivando complementar a pesquisa em andamento pretendemos empregar técnicas de evolução in vitro (DNA shuffling) para a seleção de mutantes do gene HGPRT de Leishmania. Esses serão sequenciados e estudos cinéticos serão realizados. As enzimas mutadas poderão ser posteriormente cristalizadas e sua estrutura resolvida. Esta informação levará a um melhor entendimento do mecanismo de catálise e ao desenho de inibidores.