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Item Structure and function of enzymes and auxiliary proteins from Trichoderma, active in cell-wall hydrolysis(2017-05-29) Polikarpov, IgorLignocellulosic biomass, such as sugarcane bagasse, holds a promise of environmentally friendly bioenergy production in Brazil. However, enzymatic hydrolysis, currently considered a method of choice in biomass saccharification, is hampered by considerable cell-wall recalcitrance. To make this technology sustainable and cost effective, our comprehension of cellulose enzymatic hydrolysis should be significantly improved. Here we propose to conduct systematic structure-functional studies of Trichoderma cellulases and auxiliary proteins active in cell-wall degradation using a combination of X-ray protein crystallography, biophysical and biochemical studies, molecular dynamics simulations, statistical coupling analysis aligned with the site-directed mutagenesis and enzymatic assays aiming to obtain in-depth comprehension of cellulose hydrolysis. We plan to contribute toward structural analysis of Trichoderma reesei endoglucanases by solving a crystal structure of endoglucanase II (Cel5A), main enzymatically active, but structurally uncharacterized endoglucanase of this important industrial fungus. Moreover, we will contribute toward our knowledge of Trichoderma cellulases molecular organization by solving X-ray structures of main Trichoderma harzianum endo- and exoglucanases (primarily focusing on Cel7A and Cel5A) and by comparing them with the correspondent T. reesei enzymes. We also aim to structurally characterize swollenins, non-hydrolytic proteins, shown to enhance cellulose hydrolysis catalyzed by celulases, and to study thermodynamically its interactions with cellulose. In addition, we will construct chimeric enzymes by fusing of swollenin with the cellulases and will study enzymatic properties of such chimeras. Furthermore, we will conduct systematic molecular dynamics studies of the cellulases and swollenin, and investigate their flexibility by hydrogen deuterium exchange followed by massspectrometry. Finally, we will use all these acquired knowledge to modify the proteins using site-directed mutagenesis aiming to better comprehend molecular basis of their function and to produce enzymes and their mixtures with enhanced hydrolytic properties.Item Produção heteróloga, caracterização e engenharia de Xilose isomerases para aplicação na fermentação industrial de pentoses.(2017-05-29) Polikarpov, IgorPara tornar a produção de etanol de segunda geração economicamente sustentável, é imprescindível utilizar fração hemicelulósica. As pentoses (P5), que compõem a hemicelulose, não são fermentescíveis pelas leveduras (Saccharomyces cerevisiae) utilizadas pela indústria brasileira. A xilose, uma fração predominante de P5, pode ser robustamente convertida pela ação de xilose isomerases (Xls) em xilulose, que, por sua vez, é facilmente fermentada pela S. cerevisiae. Neste projeto estamos propondo utilizar ferramentas modernas de bioinformática, genética, expressão heteróloga de alta produtividade e Biologia/Bioquímica Molecular Estrutural para identificar, clonar e expressar em larga escala Xls novas e potencialmente patenteáveis. Estamos objetivando também o estudo enzimático e de modificação das mesmas usando engenharia de proteínas, visando produzir enzimas com alta atividade enzimática e perfis de pH e temperatura compatíveis às condições do processo industrial brasileiro. Além disso, imobilizaremos as Xls otimizadas para aumentar sua vida útil e viabilizar seu reciclo. Faremos pré-tratamento do bagaço da cana para obter um hidrolisado hemicelulósico, e conduziremos testes de isomerização e fermentação simultâneos de P5 usando leveduras comerciais e industriais em condições reacionais próximas às encontradas nas usinas do País. É importante ressaltar que este processo não utiliza organismos geneticamente modificados e é, portanto mais facilmente escalonável para os processos industriais brasileiros.