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Item Structure and function of enzymes and auxiliary proteins from Trichoderma, active in cell-wall hydrolysis(2017-05-29) Polikarpov, IgorLignocellulosic biomass, such as sugarcane bagasse, holds a promise of environmentally friendly bioenergy production in Brazil. However, enzymatic hydrolysis, currently considered a method of choice in biomass saccharification, is hampered by considerable cell-wall recalcitrance. To make this technology sustainable and cost effective, our comprehension of cellulose enzymatic hydrolysis should be significantly improved. Here we propose to conduct systematic structure-functional studies of Trichoderma cellulases and auxiliary proteins active in cell-wall degradation using a combination of X-ray protein crystallography, biophysical and biochemical studies, molecular dynamics simulations, statistical coupling analysis aligned with the site-directed mutagenesis and enzymatic assays aiming to obtain in-depth comprehension of cellulose hydrolysis. We plan to contribute toward structural analysis of Trichoderma reesei endoglucanases by solving a crystal structure of endoglucanase II (Cel5A), main enzymatically active, but structurally uncharacterized endoglucanase of this important industrial fungus. Moreover, we will contribute toward our knowledge of Trichoderma cellulases molecular organization by solving X-ray structures of main Trichoderma harzianum endo- and exoglucanases (primarily focusing on Cel7A and Cel5A) and by comparing them with the correspondent T. reesei enzymes. We also aim to structurally characterize swollenins, non-hydrolytic proteins, shown to enhance cellulose hydrolysis catalyzed by celulases, and to study thermodynamically its interactions with cellulose. In addition, we will construct chimeric enzymes by fusing of swollenin with the cellulases and will study enzymatic properties of such chimeras. Furthermore, we will conduct systematic molecular dynamics studies of the cellulases and swollenin, and investigate their flexibility by hydrogen deuterium exchange followed by massspectrometry. Finally, we will use all these acquired knowledge to modify the proteins using site-directed mutagenesis aiming to better comprehend molecular basis of their function and to produce enzymes and their mixtures with enhanced hydrolytic properties.Item Produção heteróloga, caracterização e engenharia de Xilose isomerases para aplicação na fermentação industrial de pentoses.(2017-05-29) Polikarpov, IgorPara tornar a produção de etanol de segunda geração economicamente sustentável, é imprescindível utilizar fração hemicelulósica. As pentoses (P5), que compõem a hemicelulose, não são fermentescíveis pelas leveduras (Saccharomyces cerevisiae) utilizadas pela indústria brasileira. A xilose, uma fração predominante de P5, pode ser robustamente convertida pela ação de xilose isomerases (Xls) em xilulose, que, por sua vez, é facilmente fermentada pela S. cerevisiae. Neste projeto estamos propondo utilizar ferramentas modernas de bioinformática, genética, expressão heteróloga de alta produtividade e Biologia/Bioquímica Molecular Estrutural para identificar, clonar e expressar em larga escala Xls novas e potencialmente patenteáveis. Estamos objetivando também o estudo enzimático e de modificação das mesmas usando engenharia de proteínas, visando produzir enzimas com alta atividade enzimática e perfis de pH e temperatura compatíveis às condições do processo industrial brasileiro. Além disso, imobilizaremos as Xls otimizadas para aumentar sua vida útil e viabilizar seu reciclo. Faremos pré-tratamento do bagaço da cana para obter um hidrolisado hemicelulósico, e conduziremos testes de isomerização e fermentação simultâneos de P5 usando leveduras comerciais e industriais em condições reacionais próximas às encontradas nas usinas do País. É importante ressaltar que este processo não utiliza organismos geneticamente modificados e é, portanto mais facilmente escalonável para os processos industriais brasileiros.Item Estudos estruturais de proteínas usando luz síncrotron(2017-05-29) Polikarpov, IgorAté o presente momento a cristalografia macromolecular é o método mais poderoso e também o mais utilizado para a solução de estrutura tridimensional de proteínas e ácidos nucleicos com resolução atômica ou quase atômica. Estas estruturas tridimensionais estão contribuindo na compreensão de vários processos presentes nas células vivas, tais como catalização enzimática, resposta imunológica, infeção viral, divisão celular, transferência de informação genética, entre outros. Além disso, o conhecimento das estruturas das proteínas é essencial para o desenho de novas drogas e modificações de proteínas através da engenharia genética. O Brasil é único país do Hemisfério sul que possui síncrotron com linha de luz dedicada a cristalografia de proteínas. A linha de luz que começou a funcionar cerca de um ano e meio atrás, apresenta o fluxo de raios-X bastante elevado e já serviu para realização de mais de 60 diferentes projetos cristalográficos do Brasil e de outros países como Argentina, México, Rússia, Alemanha, Austrália e Estados Unidos. O interesse principal deste projeto é o desenvolvimento de métodos e equipamentos específicos ao estudo de cristalografia de proteínas com luz síncrotron, bem como a otimização destes métodos para condições de coleta de dados na linha de cristalografia de proteínas do LNLS. Isto tornaria mais fácil e mais rápido a determinação da estrutura tridimensional (3D)de moléculas de proteínas para a compreensão das suas funções. Otimização de coleta de dados nativos e derivados, incluindo técnicas de substituição isomorfa múltipla/simples com espalhamento anômalo (MIRASISIRAS) e difração anômala à único/múltiplos comprimento(s) de onda (SADIMAD), será aplicada no caso de quinze projetos estruturais diferentes. Estes sub-projetos serão resolvidos usando o métodos de substituição molecular (II.1, II.2, II.5- II.8, II.12- II.15 e, possivelmente,11.4), técnicas de substituição isomorfa e difração anômala (II.3, II.4, II.9- II.11). Estudos estruturais com resolução atômica serão realizados dentro do sub-projeto II. 14, e possivelmente outros sub-projetos. Técnicas crio-cristalográficas estão sendo otimizadas para uso na linha de cristalografia de proteínas do LNLS e serão plenamente usadas durante de execução do projeto. Sub-projetos estruturais estão direcionados para estudos de proteínas relacionadas com problemas de saúde humana (II. 1, II.3, II.4, II.6), infecção viral (II.5), tratamento de câncer (II.2), processos inflamatórios (II.7), envenenamento(II.14, II.15); aplicações industriais (II.9- II.11); estudos biológicos de proteínas glicosiladas (H. 1, 11. 8-H.11) e proteínas da via glicolítica (11. 12, H. 13).As proteínas em estudo variam de pequeno peptídeo não-glicosilado (7.5kDa) a moléculas grandes e pesadamente glicosiladas (~100 kDa, 15% de glicolisação). As técnicas de luz síncrotron são o pivô e o elo de ligação dos projetos. Muitos deles seriam difíceis ou, as vezes impossíveis, de serem realizados sem uso de luz síncrotron. Desenvolvimento de técnicas modernas de uso de luz síncrotron aplicadas à biologia molecular estrutural e testes rigorosos das mesmas durante execução de grande número de projetos estruturais aumentará significativamente a velocidade e qualidade de coleta de dados e resolução das estruturas. Isto criará a base para futuros projetos de genoma estrutural e desenho racional de fármacos. Os avanços técnicos e tecnológicos alcançados durante a execução deste projeto beneficiarão toda a comunidade cristalográfica do Brasil e Mercosul. A riqueza de informação estrutural coletada neste projeto poderá sugerir novas soluções para problemas relacionados a saúde humana, medicina e aplicações industriais. O projeto temático esta dividido em duas partes: estudos metodológicos e estudos estruturais. Na parte dos estudos metodológicos prevemos otimizar os métodos de coleta de dados de difração dos cristais nativos e derivados com luz síncrotron, visando particularmente resolução das estruturas inéditas. Na parte dos estudos estruturais apresentamos 15 propostas de pesquisa de determinação das várias estruturas protéicas de interesse biológico.Item Biofísica estrutural dos receptores nucleares e proteínas relacionadas(2017-05-29) Polikarpov, IgorOs receptores nucleares estão dentre as mais importantes moléculas envolvidas na regulação intracelular, pois participam na transmissão de diferentes sinais internos e externos para a regulação de programas genéticos. A programação genética estabelecida ou modificada por essas proteínas afeta praticamente todos os aspectos da vida de organismos multicelulares. A regulação transcricional e a seletividade promovida pelos receptores nucleares estimulam a intensa pesquisa que vêm sendo realizada na tentativa de decifrar a complexa rede de eventos moleculares que promovem a sua capacidade de regulação da transcrição e descobrir as regras que definem seu controle, no espaço e no tempo, sobre as interações proteína-proteína e proteína-DNA, abrindo possibilidades para o desenvolvimento de drogas mais eficientes com valores terapêuticos superiores. No presente projeto, planeja-se estudar os receptores nucleares por cristalografia de proteínas, espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), métodos bioquímicos e biofísicos, bem como por simulações biocomputacionais, para se entender como a ligação de ligantes específicos (agonistas e antagonistas) induz respostas conformacionais na estrutura tridimensional dos receptores e influencia seus estados de oligomerização e as interações com proteínas co-reguladoreas (co-ativadoras e co-repressoras), bem como modifica a sua estabilidade. Planeja-se também estudar o reconhecimento dos elementos responsivos de DNA por receptores nucleares por cristalografia de proteínas, SAXS e anisotropia de fluorescência. Finalmente, planeja-se investigar papel de dinâmica dos receptores nucleares no seu funcionamento, objetivando determinação dos caminhos preferenciais de dissociação dos ligantes dos receptores nucleares através de simulações computacionais pro dinâmica molecular e os estudos experimentais das mudanças da mobilidade dos receptores usando a técnica de troca hidrogênio/deutério em combinação de espectroscopia de massa. É importante ressaltar que estas são metas com impacto imediato na procura racional de agonistas ou antagonistas hormonais e se inserem dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico na área de receptores nucleares com vínculos estreitos com os interesses da indústria farmacêutica, da medicina e do setor produtivo.Item EMU: facility para estudos avançados de materiais nanoestruturados e biossistemas / FAMA(2017-05-29) Polikarpov, IgorEsta proposta visa modernizar e ampliar um Laboratório Multiusuário Centralizado (Facility), que funciona há mais de 20 anos no IFSC/ USP fazendo pesquisas e prestando serviços em materiais inorgânicos e orgânicos por meio das técnicas de microscopia eletrônica de varredura (SEM), microscopia de força atômica (AFM) e difração de raios-X (DRX), atendendo pesquisadores do Estado de São Paulo e de outros estados da federação. A modernização e a ampliação agregarão técnicas modernas de microscopia confocal e difração de raios-X com duplo comprimento de onda, como também de microscopia de alta resolução, adquirindo um microscópio eletrônico SEMFEG e um microscópio de força atômica (AFM) de última geração. Com esta expansão do laboratório será possível estender a gama de materiais investigados e atender a um maior número de pesquisadores, com pessoal altamente qualificado. Além disso, a ênfase multidisciplinar crescente do IFSC trouxe demandas novas por metodologias que possibilitem investigar nanoestruturas orgânicas e inorgânicas, matéria mole, biomassa e biossistemas em geral (microscopia confocal). O projeto é apoiado por dois Cepids da FAPESP, três INCTs, três Temáticos, um projeto regular da FAPESP e um projeto da Finep, como projetos associados, que totalizam mais de R$ 75 milhões em recursos financeiros, além de vários projetos complementares. Nesses projetos busca-se compreender processos físicos, físico-químicos e biológicos na escala atômica e nanométrica, em áreas de fronteira em que os grupos participantes desta proposta têm contribuições relevantes no cenário internacional. Devido à abrangência estadual e nacional de alguns dos projetos associados, um número considerável de pesquisadores e especialistas em inovação tecnológica do Estado de São Paulo será beneficiado, principalmente com a infraestrutura e capacitação de técnicos do IFSC para compartilhar equipamentos multiusuários.Item Estabelecimento de uma colaboração para estudos sistemáticos de proteínas transportadoras presentes em membranas através da cristalografia de macromoléculas(2017-05-11) Polikarpov, IgorAs bactérias gram-negativas possuem uma membrana celular dupla que lhes proporcionam uma camada extra de proteção, todavia, dificulta a passagem, por exemplo, de alvos terapêuticos e de substratos para subsequente fermentação. Dessa maneira, a compreensão do envelope celular em detalhes moleculares é essencial para o aprimoramento de nossas habilidades em explorar suas fragilidades para aplicações médicas e ampliaria a eficiência na obtenção do biocombustível. Contudo, devido à dificuldade no estudo das proteínas de membrana, até a presente data, a cristalografia de raios-X de proteínas de membrana ainda é inacessível no Brasil. Este projeto alvitra a consolidação de uma união entre dois grupos de pesquisa em universidades de excelência, a Universidade Birmingham (UoB) e a Universidade de São Paulo (USP), e aponta, pela primeira vez, estabelecer um estudo estrutural colaborativo especializado em proteínas de membrana e que será de grande benefício para ambas as instituições.Item Target analysis of microbial lignocellulytic secretomes: a new approach to enzyme discovery(2016-11-04) Polikarpov, IgorFrom both a fundamental and industrial biotech viewpoint understanding the deconstruction of lignocellulose in soil and compost is of central importance. In the natural environments microbial communities can efficiently degrade or modify lignin to enable the effective enzymatic hydrolysis of the polysaccharides present in plant cell walls. The aim of this proposal is to use metatranscriptomics and proteomics to determine gene - and protein - centred details to determine new mechanisms and improved methods of lignocellulose deconstruction in mixed microbial communities from composting wheat straw and sugar cane bagasse. Secreted proteins will be tagged, affinity purified and analyzed by LC-ESI-MS. In order to have a picture of the overall community dynamics in terms of species composition during the composting process DNA will be extracted for SSU rRNA profiling: Saccharification of the lignocellulose will be monitored and the lignin content of the straw or bagasse analyzed using FTIR spectroscopy and solid state NMR. Metatranscriptome analysis will be performed by preparing cDNA from samples taken at various time points from the Iignocellulose enriched cultures, the cDNA will be sequenced using the Roche 454 GS FLX Titanium platform. The peptide sequences from the proteomics analysis will allow the identification of full and partial coding sequences in the library. These coding sequences will be cloned and expressed in established recombinant expression systems and the recombinant proteins screened for activity.Item Centro de processos biológicos e industriais para biocombustíveis - CeProBIO(2016-06-16) Polikarpov, IgorCeProBIO está propondo um modelo industrial de produção de etanol celulósico que seja passível de integração ao arranjo produtivo já existente em regiões desenvolvidas do Brasil ou, alternativamente, que possa ser implementado em áreas cuja infraestrutura agroindustrial esteja ainda em fase de implementação e consolidação. Este modelo inovador prevê a diminuição drástica e eventual eliminação total da necessidade de qualquer insumo de origem fóssil através do reaproveitamento dos resíduos, efluentes e emissões na geração de energia e produção de produtos químicos de valor. Atualmente, a produção industrial de etanol celulósico não é viável economicamente. Sua sustentabilidade econômica, ambiental e social só poderá ser alcançada por meio de um esforço orquestrado de ações voltadas para a pesquisa científica fundamental, aplicada e tecnológica. Para isto, o CeProBIO está estruturado nos oito projetos principais acima listados, calcados nas áreas de genética, genômica, biologia molecular e estrutural, física, química, bioinformática e computação, engenharia agronômica, microbiologia, enzimas, e processos industriais avançados. Assim, a missão do CeProBIO será promover e integrar a multidisciplinaridade e transdisciplinaridade, onde áreas tradicionais terão suas fronteiras estendidas e transgredidas, permitindo uma sinergia inédita entre os grupos, o que é absolutamente necessário para solução do problemas da produção de biocombustíveis da segunda geração em larga escala. O principal problema da produção do etanol celulósico é a recalcitrância da biomassa no processo da hidrólise. Para conversão da biomassa em açúcares simples (pentoses e hexoses) e co-produtos (lignina, ceras, etc) é de suma importância saber a composição físico-química e estrutural da parede celular e poder desenvolver plantas com propriedades desejadas. Para isso precisamos compreender a fundo a genética e genômica de plantas. Os Projetos 1 e 2 são focados nestes objetivos, tendo a cana-de-açúcar, como principal objeto de estudo. O Projeto 3visa estudo de outros tipos de biomassa como Panicum maximum Jacq, Brachiaria brisantha, capim elefante, madeira e casca de eucalipto, tachi-branco e paricá e sua aplicabilidade para produção de etanol celulósico. Em complementação, o Projeto 4 objetiva entender profundamente as estruturas químicas e físicas de paredes celulares vegetais, entender como eles foram sintetizadas e como possam ser desconstruídas. A hidrólise da biomassa exige desenvolvimento de melhores preparados enzimáticos principalmente para hidrólise da celulose, mas também hemicelulose e Iignina. Este desenvolvimento necessariamente passa pela identificação e manipulação de micro-organismos (principalmente fungos filamentosos e bactérias), identificação, caracterização e melhorias das enzimas (exo- e endoglucanases e beta-glicosidases) e outras proteínas auxiliadoras e integração dos processos de hidrólise com os de pré-tratamento da biomassa. Estes estudos fazem parte do Projeto S. No Projeto 6 pretendemos estabelecer e implementar processos tecnológicos avançados para produção de bioetanol de segunda geração em escala industrial, otimizando suas operações básicas (pré-tratamento, produção de preparados enzimáticos, hidrólise, fermentação e destilação), de forma a melhorar o desempenho e agregar valor aos subprodutos do processo. Fazem parte da nossa visão os benefícios de integração dos processos de produção do álcool da primeira geração com o bioetanol celulósico da segunda geração, tendo em vista aproveitamento da mesma estrutura industrial de carregamento, pré-tratamento mecânico e fermentação e destilação, bem como sistemas térmicos e elétricos da estrutura da usina. Entretanto, novos desafios científicos e tecnológicos, como fermentação de pentoses, inibição de fermentação pelos compostos tóxicos originários do pré-tratamento da biomassa e otimização de uso de subprodutos do processo industrial, também fazem parte do Projeto 6. Ainda neste projeto, a vinhaça resultante do processo industrial será tratada por meio de fermentação bacteriana anaeróbia para a produção de biogases combustíveis (hidrogênio, metano) e ácidos orgânicos (ácido láctico, ácido acético e outros), estes últimos insumos para produção de plásticos biodegradáveis e outros produtos químicos "verdes". Esta tecnologia também contribuirá para a implementação de nosso modelo de ciclo industrial fechado. Para melhor utilização de resíduos gerados no processo fermentativo, pretendemos desenvolver e implementar processos tecnológicos da produção do biodiesel de microalgas (Projeto 7). Neste projeto objetivamos desenvolver fotobiorreatores para cultivo industrial de microalgas a altíssimas concentrações, usando vinhoto e CO2 gerado no processo na produção do bioetanol. Embora microalgas sejam capazes de acumular até 70% do seu peso seco em gordura, os fotobiorreatores atuais demandam uma área de cultivo excessivamente grande para a produção de biomassa algal em quantidades necessárias. Por isso, o desenvolvimento de fotorbioreatores eficientes capazes de garantir produção de grande massa algal para produção de biodiesel representa considerável problema de engenharia. O aproveitamento dos resíduos do processo de bioetanol, conforme nosso modelo industrial, não somente permitirá reduzir o uso de combustíveis fosseis (diesel usando na coleta e transporte da cana-de-açúcar) como também reduzir a emissão de gás dióxido de carbono na produção de bioetanol da primeira e segunda geração. É importante ressaltar que tecnologias de produção de biocombustíveis a partir de biomassas de algas possam ser acopladas não somente ao processo de produção do bioetanol, mas também aos vários outros processos industriais e de geração de energia (como termoelétrica, por exemplo). Otimização de catálise enzimática na produção de biodiesel também faz parte do Projeto 7.Finalmente, no Projeto 8abordaremos vários aspectos de sustentabilidade, questões ambientais e impactos da produção de biocombustíveis no uso da água e na emissão de carbono. Estes projetos estão profundamente integrados à proposta irmã SUNLlBB da União Europeia que visa melhorias na qualidade da biomassa, melhoras na eficiência econômica do processo de conversão da biomassa em biocombustíveis através da agregação de co produtos de maior valor agregado, melhorias no processo de conversão (pré-tratamento, identificação de novas atividades enzimáticas, desenvolvimento de processo integrado, modelos computacionais para biorefinarias). Concomitantemente ao nosso projeto, a proposta europeia SUNLlBB também vai se debruçar sobre os problemas reacionados aos impactos sociais e econômicos da produção industrial de etanol celulósico. A complementaridade entre os projetos vai se dar através de focos diferentes na escolha da principal biomassa em estudo (cana-de-açúcar no CeProBIO e miscantus no SUNLlBB) através de estudos conjuntos de enzimas industriais e desenvolvimento de novos coquetéis enzimáticos, aprimoramento de diversos tipos de pré-tratamentos e processos de sacarificação em larga escala, análise da estrutura fina da parede celular vegetal, extração de coprodutos tais como ceras e compostos químicos de maior valor agregado.