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Contribuição da técnica de RPE no estudo de três diferentes sistemas: complexos de Cu(II)- Aliina; Cu(II)-bdfpo e hemoproteínas com diferentes graus de hidratação
(2014-08-18) Martin Neto, Ladislau
Neste trabalho são apresentados estudos em três diferentes sistemas utilizando-se as técnicas de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) e absorção eletrônica. No primeiro estudou-se a formação dos possíveis complexos entre o aminoácido aliina, extraído do alho, e o íon cobre (II). Os dados de RPE e absorção eletronica no visível (400-1100 nm) foram utilizados para caracterizar os diferentes complexos obtidos. No segundo utilizou-se o monocristal do complexo dicloro bis (benzil difenil fosfinóxido) Cobre (II) e efetuaram-se medidas de RPE variando-se a direção de aplicação do campo magnético no monocristal. Os auto-valores encontrados para as componentes do tensor g¯ foram: g1= 2,0891; g2= 2,4554 e g3= 2,0767. Com base nos dados de RPE e cristalográficos e usando a teoria de campo cristalino foi proposto dxy como estado fundamental para o íon cobre (II) neste complexo. Fez-se também um estudo preliminar observando-se as variações no centro ativo de hemoproteínas moduladas pelo grau de hidratação. Metahemoglobina bovina e metamioglobina eqüina liofilizadas foram usadas e o sinal de RPE do íon ferro (III) monitorado. Dos espectros de RPE das duas proteínas são observadas pelo menos duas simetrias para o íon ferro (III), uma axial caracterizada por um valor de g próximo de 6 e outra caracterizada por g= 4,3 correspondendo a simetria rômbica. A intensidade dos sinais mostrou-se muito sensíveis ao grau de hidratação. Metahemoglobina e metamioglobina apresentaram comportamentos distintos dos sinais de RPE e sugeriu-se serem eles devido as diferenças estruturais entre as duas proteínas
O papel da água de hidratação na estrutura e conformação de hemoproteínas visto pelas mudanças na simetria e estado de spin do centro ativo: um estudo por RPE
(2014-03-11) Martin Neto, Ladislau
Neste trabalho foi estudado a influência da água na estabilização da estrutura e conformação da mioglobina (Mb) e hemoglobina (Hb) através de mudanças no centro ativo (grupo heme), detectadas por Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE). Utilizou-se os derivados meta Mb e nitrosil-Mb de baleia, meta Mb eqüina, meta Hb humana e meta Hb bovina. Amostras com diferentes graus de hidratação (0 a 0,50g H2/g proteína) foram submetidas as medidas de RPE, a T= -160°C, acompanhando o sinal do íon ferro (III) nas metas Mb (e Hb) e do grupo NO na nitrosil-Mb. A fração populacional dos complexos formados foram obtidos a partir da integral dupla do espectro de RPE. Na desidratação da meta Mb 65% das moléculas perderam a água da sexta coordenação do ferro (III) dando origem a outros complexos. Um desses complexos foi o hemicromo H (bi-histidina) onde um átomo de nitrogênio da histidina distal E7 se coordena ao ferro, com a hélice E se movimentando em direção ao heme. Adicionalmente a formação do hemicromo observou-se uma diminuição de 40% de moléculas detectáveis por RPE, na desidratação, e sugeriu-se a formação de moléculas com ferro reduzido [Fe (II)] como explicação para essa redução. Foi observado também um alargamento da linha com g ≈ 6 para as amostras com graus de hidratação menores que 0,20g H2O/g Mb devido a desvios da simetria axial em torno do íon ferro (III). Esses desvios de simetria foi proposto originar-se de distorções conformacionais nas amostras com baixa hidratação. Em níveis de hidratação acima de 0,20g H2O/g Mb observou-se um aumento considerável de centros detectáveis por RPE com a recuperação de moléculas com a forma meta. Na meta Hb somente 5% das moléculas permaneceram com a água da sexta coordenação do ferro após a desidratação. As outras 95% das moléculas deram origem a dois tipos de hemicromos (55%) e moléculas de Fe2+ (40%). Foram formados o hemicromo H e principalmente o hemicromo P (o 5° ligante do ferro deve ser o átomo de enxofre da cisteína da cadeia β posição 93 (𗇥), vizinho da histidina proximal 𗇤 que é deslocada, e o 6° ligante é proposto ser o nitrogênio da histidina distal E7). Em um nível de hidratação em torno de 0,40g H2O/g Hb há um aumento considerável de moléculas que voltam a ter a água na 6° coordenação do ferro com o concomitante decréscimo da quantidade de hemicromos e de moléculas com ferro (II). Na adição do gás NO nas amostras de meta Mb de baleia com diferentes graus de hidratação houve a formação significante do complexo Fe2+ - NO somente abaixo de 0,25g H2O/g Mb. Em valores superiores de hidratação (até 0,50g H2O/g Mb) as amostras tornaram-se praticamente diamagnética, após a adição do NO, com a formação do complexo Fe2+ - NO+. Os resultados foram interpretados supondo que o NO reage diretamente com íons Fe2+ disponíveis abaixo de 0,25g H2O/g Hb formando o complexo Fe2+ - NO paramagnético. Em hidratações superiores como praticamente não há mais íons Fe2+ disponíveis o NO reduz o Fe3+ parando no intermediário Fe2+ - NO+ - diamagnético. O espectro tripleto observado para o NO em baixa hidratação na Mb é associado a um complexo onde o ferro (II) está pentacoordenado. Isso indica que a histidina proximal F8 se afastou do heme tornando possível a entrada de um novo grupo em seu lugar