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Propriedades físico-químicas da lectina KM+ monitoradas por dicroismo circular (CD) e fluorescência. Estimativa do conteúdo de estrutura secundaria por CD
(2014-04-02) Lucca, Rosemeire Aparecida da Silva de
Uma nova lectina extraída da semente de Artocarpus integrifólia, denominada KM+ foi recentemente descrita. KM+ e haptotática para neutrófilos, promove a aglutinação de hemácias dos grupos A, B, 0, estimula a proliferação de linfócitos do baço de camundongos e liga-se em α D-manose, α metil manosidio e α D-glicose. Esta lectina é composta por quatro monômeros, com peso molecular de 13.150 daltons cada, unidos por interações não covalentes. KM+ contem 1,8% de carboidratos e apresentou quatro isoformas com pontos isoelétricos entre 4,2 e 5,2. Este trabalho teve como objetivos estudar modificações estruturais de KM+ em função de parâmetros como temperatura, força iônica, pH, agentes desnaturantes, ligação com D-manose, monitoradas por dicroísmo circular (CD) e fluorescência. CD também foi utilizado para estimar o conteúdo de estrutura secundaria de KM+, utilizando-se dois programas descritos na literatura: SSE (Secondary Structure Estimation), que utiliza o método dos mínimos quadrados para a estimativa da estrutura secundaria e obtenção dos espectros básicos, baseados nos dados cristalográficos de proteínas de .estrutura resolvida; CCA (Convex Constraint Analisys) que utiliza o algoritmo simplex e a partir dos espectros de CD das proteínas de referencia calcula os espectros das componentes básicas. Para a estimativa das frações de estrutura secundária o segundo método utiliza o programa Lincomb. Os espectros de CD foram registrados no intervalo de 185 a 260 nm. O conteúdo em estrutura secundária, estimado pelo programa SSE foi: 0% de α-hélice, 41% de folha β, 27% de volta β e 32,3 de estrutura desordenada; pelo programa CCA foi: 1% de α-hélice, 35% de folha β anti-paralela, 21% de volta β e/ou folha β paralela, 15% de contribuições de aromáticos e/ou ligações dissulfeto, 28% de estrutura desordenada. Os desvios médios quadráticos para os programas SSE e CCA foram 12% e 1%, respectivamente. Portanto a lectina KM+ é principalmente constituída por estruturas tipo folha β e tipo desordenada. A curva calculada pelo programa CCA foi mais bem estimada, pois tem o desvio médio quadrático 12 vezes menor que o do programa SSE. Este resultado, provavelmente ocorre devido aos seguintes fatores: (i) no programa CCA, o espectro da proteína a ser analisada e alinhado com os espectros das proteínas de referência, influenciando no calculo dos espectros básicos; (ii) maior número de proteínas com estrutura β no grupo de referência do programa CCA. A estabilidade de KM+ em função da temperatura tem comportamento diferente em tampão sódio fosfato (PBS) daquele observado em água. Em PBS, quando a amostra esta a 70°C, a forma do espectro de CD mostrou-se consistente com um espectro de proteína desnaturada. Comumente, um espectro de proteína desnaturada caracteriza-se pela perda da estrutura secundaria predominante e aumento da estrutura desordenada. Em água, também a 70°C, na região da estrutura β (216 nm) surge uma nova banda e na região da estrutura desordenada (195 nm) aparece uma banda com valores positivos mimetizando um espectro da estrutura α-hélice. Esta diferença de comportamento pode ser devida à força iônica. A desorganização promovida na molécula de KM+ por cloreto de guanidina foi típica de desnaturação. o máximo da emissão de fluorescência, da KM+ em PBS pH 7,2, foi a 328 nm, característico de resíduos de triptofano protegidos do solvente. Este máximo mudou para 340 nm em pH 10,5. Este resultado indica mudanças no ambiente químico do triptofano neste pH. O deslocamento para a região do vermelho indica, que em pH. os resíduos de triptofano estio em maior contato com o solvente. O número de sitios ligantes de D-manose J)a molécula de KM+, foi estimado pela supressão da fluorescência promovida pelo D-manose. Esta estimativa foi baseada na suposição de que todos os sítios ligantes de D-manose estivessem próximos aos resíduos de triptofano. A relação encontrada foi de 2 moles de D-manose/mol de KM+