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Ácidos graxos de cadeia média como ligantes da proteína PPAR
(2009-03-24) Liberato, Marcelo Vizoná
Receptores ativados da proliferação de peroxissomos (PPAR) são receptores nucleares que regulam o metabolismo de gordura e glicose, adipogênese e polarização de macrófagos, e são os mediadores da ação de uma grande classe de fármacos usada no tratamento de diabetes tipo 2, as tiazolidinadionas (TZD). Enquanto as TZDs reduzem a glicose do sangue e aumentam efetivamente a sensibilidade à insulina, elas podem também apresentar efeitos colaterais como aumento do risco de complicações cardiovasculares, ganho de peso, retenção de fluido e toxicidade hepática. Por causa disso, novos fármacos que possuem respostas mais favoráveis devem ser desenvolvidos, e o mecanismo de ativação do PPAR por ligantes vem sendo intensamente examinado. Para entender a relação entre a ligação de agonistas ao PPAR e a ativação transcricional, pretendíamos primeiramente obter cristais de PPAR-LBD (domínio de ligação ao ligante) humano na forma apo. Porém, surpreendentemente, a análise do sítio de ligação ao ligante revelou a presença de três pequenas moléculas, identificadas como ácidos nonanoicos e octanoicos. Este trabalho reporta a análise da estrutura cristalográfica do PPAR LBD complexado simultaneamente com três ácidos graxos de cadeia média (AGCM), provindos de bactérias (organismo de expressão), localizados no sítio de ligação ao ligante. A análise estrutural e funcional sugere que os AGCM são agonistas parciais que estabilizam a conformação do LBD do PPAR por mecanismo independente da hélice 12.
Caracterização estrutural de endoglucanases da família GH5 e beta-glicosidases da família GH1: interação enzima-substrato
(2014-01-30) Liberato, Marcelo Vizoná
A celulose é o biopolímero de maior abundância no mundo e tem potencial para se tornar fonte de energia renovável através de sua transformação em açúcares fermentáveis, que por sua vez serão transformados em etanol. A recalcitrância da celulose, principal dificuldade encontrada no processo, pode ser superada com o auxílio de enzimas (celulases). Ao menos três enzimas celulolíticas são necessárias para a degradação total da celulose, incluindo as celobioidrolases, que hidrolisam as ligações glicosídicas das extremidades redutoras e não redutoras da cadeia, as endoglucanases, que clivam a cadeia de celulose amorfa randomicamente, e as beta-glicosidases, que produzem glicose através dos celo-oligômeros. Mas para que esse processo se torne financeiramente viável é necessário conhecer o funcionamento, otimizar a atividade e aumentar a produção dessas celulases. Com o intuito de avançar na compreensão da função e estrutura dessas enzimas, o presente trabalho teve como objetivo o estudo estrutural de beta-glicosidases da família GH1 e endoglucanases da família GH5. Na primeira parte do trabalho, a expressão da endoglucanase II de Trichoderma reesei não foi alcançada, mesmo utilizando diferentes organismos e condições de expressão. Porém, na segunda etapa, foi obtida a expressão, purificação e os primeiros ensaios de cristalização de 11 beta-glicosidases bacterianas da família GH1 e 8 endoglucanases bacterianas da família GH5. Dentre elas, três beta-glicosidases e uma endoglucanase de Bacillus licheniformis foram cristalizadas e tiveram sua estrutura resolvida. As beta-glicosidases, apesar de possuírem o enovelamente similar, apresentaram variações no tamanho e posição das alças formadoras da fenda catalítica e divergem em relação a um dos aminoácidos importantes para a estabilização do substrato. Essas diferenças podem ajudar a explicar o mecanismo dessas enzimas para reconhecer substratos distintos. A endoglucanase da família GH5, possuindo dois módulos acessórios, foi cristalizada tanto na forma apo quanto complexada ao substrato celotetraose. O segundo módulo acessório possivelmente é um domínio de ligação à celulose (CBM) e seus resíduos aromáticos, que são responsáveis pela interação com o substrato, parecem complementar o sítio catalítico, sendo assim um novo mecanismo de auxílio enzimático de um CBM. O primeiro módulo acessório não possui um aparente sítio de interação com carboidratos e provavelmente funciona como um conector entre domínio catalítico e o CBM. O posicionamento do substrato no sítio de ligação é parecido com outras estruturas já determinadas, porém, suscita algumas dúvidas sobre a função dos resíduos catalíticos que é conservada na família. O carbono anomérico do substrato possui uma densidade eletrônica contínua com o glutamato da fita β4 (que deveria ser o ácido/base) e está mais próximo dele que do glutamato da fita β7 (que deveria ser o nucleófilo).