Navegando por Autor "Leite, Ney Ribeiro"

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    Estudos moleculares de duas triptofanil tRNA sintetases do parasita Leishmania major e de uma cisteíno protease da bactéria Xylella fastidiosa
    (2007-09-17) Leite, Ney Ribeiro
    As aminoacil tRNA sintetases (AaRSs) são enzimas essenciais na síntese de proteínas assegurando a correta relação entre os aminoácidos e seus tRNA cognatos. O genoma mitocondrial dos tripanossomatídeos perdeu os genes codificantes dos tRNAs, assim os tRNA mitocondriais são codificados no núcleo e importados do citoplasma. O código genético do kinetoplasto desvia do código genético pela utilização do códon de terminação UGA para a decodificação do códon do triptofano. Um único gene codificando o tRNATrp(CCA) observado no genoma de Leismania é responsável pela incorporação do aminoácido triptofano durante a síntese proteíca na mitocôndria. Para decodificar os dois códons do Trp (UGA e UGG) a base na posição 34 do tRNATrp(CCA) passa por um evento de editoração, convertendo o ribunuclotídeo C34 em U34, produzindo o tRNATrp(UCA) capaz de decodificar o códon UGA. Nesse trabalho foram caracterizadas duas triptofanil tRNA sintetases de Leishmania major. De acordo com experimentos de ?western blotting? e análises ?in silico? das seqüências de aminoácidos, uma enzima tem localização citoplasmática (LmTrpRS1) enquanto a outra mitocondrial (LmTrpRS2). Os mRNAs dos dois genes foram definidos por experimentos de 5? e 3? RT-PCR. As duas enzimas foram clonadas em diversos vetores de expressão procariotos e eucariotos. A LmTrpRS1 foi obtida somente na fração insolúvel, já a LmTrpRS2 foi obtida na fração solúvel quando clonada no vetor de expressão pET28a. Esta porém mostrou-se instável precipitando rapidamente após sua purificação. Os ensaios enzimáticos realizados com a mesma mostraram que ela é capaz de reconhecer os tRNAsTrp editado e não editado. Modelagem molecular por homologia com as duas proteínas foi realizada usando a proteína citoplasmática humana como molde, para estudar a interação entre a proteína e o tRNATrp. Xylella fastidiosa é um bactéria gram negativa limitada ao xilema, responsável por um grande número de doenças economicamente importantes, como a doença de Pierces em videiras, Clorose variegata do Citrus (CVC) e a doença da requeima das folhas em outras plantas incluindo, amendoeira, ameixeira, louro, amoreira e café. Em todos os casos a X. fastidiosa afeta o xylema da planta causando redução na produção de frutos. Nesse trabalho nós mostramos a estrutura da Xylellaína, uma cisteíno protease desse patógeno. A estrutura foi resolvida por dispersão anômala a um único comprimento de onda, utilizando cristais de xylellaína selenometionina substituídos. A estrutura da Xylellaína foi refinada até 1,65 Å de resolução, mostrando enovelamento similar às proteínas da família da papaína, porém algumas características interessantes como uma região N-terminal composta por 38 aminoácidos cobrindo o sulco ativo da enzima, um intrigante ribonucleotídeo encontrado fora do sítio ativo da enzima e um ?loop? semelhante ao ?loop? de oclusão presente na catepsina B.